Publicação
Dendritic cell regulation by a novel mannosylated nanovaccine
| datacite.subject.fos | Ciências da Saúde | pt_PT |
| dc.contributor.advisor | Florindo, Helena | |
| dc.contributor.advisor | Peres, Carina | |
| dc.contributor.author | Santos, Cristiana Andreia Henriques dos | |
| dc.date.accessioned | 2022-05-18T10:40:46Z | |
| dc.date.available | 2022-05-18T10:40:46Z | |
| dc.date.issued | 2021-09-21 | |
| dc.date.submitted | 2021-09-07 | |
| dc.description | Trabalho Final de Mestrado Integrado, Ciências Farmacêuticas, 2021, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia. | pt_PT |
| dc.description.abstract | O cancro é uma doença heterogénea e multifatorial caracterizada por um crescimento anormal e descontrolado das células. Algumas células cancerígenas disseminam através da corrente sanguínea ou dos vasos linfáticos. Assim, as células tumorais podem invadir outros órgãos, dando-se o nome de metástases. O cancro colorectal (CCR) é o terceiro tipo de cancro mais frequentemente diagnosticado em todo o mundo e constituiu a segunda causa de morte por cancro em 2020. O aparecimento de CCR resulta de vários fatores, entre os quais, a acumulação de alterações genéticas, epigenéticas e metabólicas, que levam à capacidade de invasão e proliferação contínua das células. A sequência complexa de desenvolvimento do CCR inicia-se normalmente com agregações de células anormais na mucosa intestinal, geralmente chamadas de pólipos. O tratamento para o CCR inclui cirurgia, radioterapia e quimioterapia. Estas terapêuticas estão associadas a certas limitações, como a toxicidade sistémica, resposta insatisfatória, resistência inata e adquirida imprevisível, e baixa seletividade para as células tumorais, o que resulta em vários efeitos adversos. Avanços recentes na terapêutica do cancro levaram a melhorias notáveis nas taxas de sobrevivência. Conquanto, a maioria dos CCR metastáticos diagnosticados ainda são incuráveis. Nas últimas décadas, a imunoterapia surgiu como uma terapêutica inovadora com capacidade para ativar e aumentar as respostas imunológicas anti-tumorais. A imunoterapia contra o cancro tem como principal objetivo utilizar o sistema imunológico do indivíduo para destruir direta ou indiretamente as células tumorais, evitando os efeitos adversos das terapêuticas convencionais. As vacinas surgiram como uma das estratégias mais promissoras tendo em vista a estimulação de respostas imunológicas contra o cancro. As vacinas terapêuticas para o cancro dependem do transporte direcionado do antigénio associado ao tumor para as células apresentadoras de antigénio, as quais subsequentemente os apresentam às células T. Nas duas últimas décadas, foram realizados vários ensaios clínicos com vacinas em doentes com CCR. No entanto, a eficácia das vacinas não foi globalmente satisfatória e ainda não existe nenhuma aprovada para o tratamento do o CCR. A capacidade de estimular adequadamente as células T depende da apresentação dos antigénios. As células dendríticas (DC) são as células apresentadoras de antigénio mais eficientes, que podem induzir e regular as respostas imunes contra o tumor. Portanto, a manipulação de DC possui grande potencial para induzir imunidade anti-tumoral. No entanto, os antigénios quando administrados sozinhos não produzem uma resposta suficientemente competente. Esta dificuldade pode ser ultrapassada com o uso de moléculas com conhecido potencial imuno-estimulador, como os agonistas dos recetores Toll-Like (TLR). Os adjuvantes têm a capacidade de estimular a resposta imune, aumentando a sua extensão e durabilidade. Assim, os adjuvantes são usados para reduzir as doses de antigénio e promover diferentes tipos de respostas imunes. O ácido polirriboinosínico-polirribocitidílico [Poly (I:C)] é um análogo sintético do RNA de cadeia dupla viral e é um agonista do TLR3. O TLR3 é expresso principalmente em DC mielóides imaturas. Além destas, o TLR3 é encontrado noutro tipo de células do sistema imunitário, incluindo células Natural Killer (NK), células T e macrófagos. Foi demonstrado que o Poly (I:C) pode induzir eficientemente a maturação de DC, promover a citotoxicidade de células NK e estimular a ativação de células T CD8+. Os oligonucleotídeos (ODN) que contêm padrões citosina-fosfato-guanosina (CpG) são agonistas do TLR9. A ligação dos CpG ODN com o TLR9 inicia uma cascata que pode promover a maturação e diferenciação de múltiplas células do sistema imunitário, incluindo células B e T, DC, células NK, monócitos e macrófagos. Evidências recentes mostram que diferentes TLR podem cooperar e interligar-se quando múltiplos agonistas são apresentados. Alguns estudos demonstraram os efeitos sinérgicos observados com a combinação de CpG e Poly (I:C). Assim, os adjuvantes têm a capacidade de melhorar a infiltração imunológica e a resposta adicional contra o antigénio. As nanoplataformas podem entregar antigénios e outras biomoléculas para as células-alvo específicas, promovendo assim a potência e durabilidade da imunidade anti-tumoral com menos efeitos adversos. Os sistemas nanométricos permitem incorporar e proteger diferentes tipos de biomoléculas, bem como melhorar o perfil farmacocinético e as suas propriedades farmacodinâmicas. Este trabalho de investigação focou-se no desenvolvimento de nanopartículas (NP) poliméricas multifuncionais que podem incorporar combinações de antigénios associados ao tumor e adjuvantes. As NP são constituídas por polímeros biodegradáveis: o ácido poliláctico (PLA) e ácido poliláctico-co-glicóglico (PLGA) modificado com manose. A funcionalização com manose tem como objetivo promover o seu direcionamento específico para as DC, que expressam o recetor da manose (CD206) na sua superfície. As NP incorporaram dois péptidos (MHC I e MHC II) e dois adjuvantes diferentes (CpG e Poly (I:C)). O antigénio incorporado foi o CEACAM5 humano, sendo um dos antigénios tumorais terapêuticos mais interessantes para vacinas contra o CCR. As NP foram preparadas pelo método de emulsão dupla (a/o/a) com evaporação de solvente. Estes nanotransportadores foram caracterizados quanto ao seu diâmetro médio, carga de superfície, eficiência de encapsulação (EE) e capacidade de carga (LC). Todas as formulações de NP apresentaram uma distribuição de tamanho estreita, com um tamanho médio próximo de 200 nm e um índice de polidispersão (PdI) inferior a 0,2 nm. As NP apresentaram uma carga de superfície ligeiramente negativa, mas próximo da neutralidade. O ensaio de viabilidade por MTT foi feito para avaliar a toxicidade das NP. As NP poliméricas não mostraram ser tóxicas nas DC imaturas JAWSII, em todas as concentrações testadas, após 24 e 48 horas de incubação. A capacidade das NP para aumentar o reconhecimento e captura de antigénios e adjuvantes por DC, bem como activar e induzir a maturação destas células, e posteriormente promover a expansão de células T foi caracterizada in vivo. Foram observadas diferenças na internalização das NP entre a população de APC do gânglio linfático inguinal. A população de APC que internalizou as NP em maior extensão foram as DC migratórias, seguido das DC residentes e por fim, os macrófagos. Por outro lado, os níveis de internalização mais altos foram observados para as DC migratórias e residentes, as principais células-alvo. Os estudos in vivo em murganhos mostraram um aumento da expressão dos marcadores de maturação CD80 e CD86 nas DC migratórias que internalizaram NP. No entanto, não foram observadas diferenças com a combinação dos dois agonistas de TLR (CpG e Poly (I:C) nem com manose. Os resultados não foram de encontro ao esperado, apresentando uma grande variabilidade. Por conseguinte, não se conseguiram tirar conclusões evidentes do ensaio de maturação. De uma forma geral, no ensaio de ativação de células T, é possível observar que a concentração de células T CD4+ e CD8+ permaneceu praticamente constante 3 e 9 dias após a administração dos tratamentos, apenas com diferença significativa em alguns grupos. Apesar das células T naïve também apresentarem um perfil semelhante entre os 3 e 9 dias, podemos observar algumas diferenças significativas entre os vários grupos de tratamento, particularmente as células T CD8 + naïve. Em geral, houve diminuição das células T CD8+ naïve quando comparadas ao grupo PBS, exceto para o grupo tratado com NP com manose e apenas CpG. Por sua vez, quanto as células CD4+ e CD8+ ativadas, algumas diferenças significativas foram observadas entre os vários grupos. Houve um aumento significativo nas células T CD8 + em todos os grupos tratados com NP, em comparação com PBS. Além disso, as NPs que co-encapsularam os dois adjuvantes e funcionalizadas com manose mostraram uma resposta CD8+ significativamente diferente quando comparada com a induzida no grupo tratado com NP com apenas CpG e sem manose. Este resultado pode sugerir uma possível vantagem de usar os dois adjuvantes e a presença de manose na superfície das NP. No entanto, neste ensaio, não é possível tirar uma conclusão clara sobre o potencial uso combinado dos dois adjuvantes, nem do uso de manose-PLA NP no aumento da ativação de células T CD8+, após 3 e 9 dias de imunização. Este trabalho de campo apresenta uma abordagem inovadora para o tratamento do CCR, destacando a importância da nanotecnologia para desenhar nanovacinas para o cancro, que possibilitem encontrar uma terapêutica eficaz anti-tumoral. Em particular, este trabalho de campo procura investigar o uso de agonistas dos TLR como adjuvantes em vacinas, nomeadamente o seu potencial sinérgico. Para além disso, foi também investigada a funcionalização nas NP com manose, particularmente a sua capacidade para direcionar as NP para as DC e ativar as células T. | pt_PT |
| dc.description.abstract | Colorectal cancer (CRC) was the third most diagnosed cancer and the second cause of cancer death worldwide in 2020. Recent advances in cancer therapy have led to improvements in survival rates, but most of the metastatic CRC (mCRC) are still incurable. Immunotherapy, namely cancer vaccination, has emerged as a hopeful strategy to activate and enhance anti-tumor immune responses. An ideal vaccination strategy involves the administration of the most immunogenic tumor-associated antigens (TAA) along with effective adjuvants in an efficient delivery vehicle. CEACAM5 is one of the interesting therapeutic TAA for peptide-based cancer vaccines. Also, the latest findings point out the potential added value of toll-like receptor (TLR) ligands, such as cytosine phosphorothioate-guanine motifs (CpG) and polyinosinic:polycytidylic acid (Poly (I:C)). This research was focused on developing multi-functional polymeric nanoparticle (NP) for the delivery of combinations of tumor antigens and adjuvants. In this work, we developed mannose-poly(lactic acid) (PLA)-based NP entrapping CEACAM5 MHC class I- and class II-restricted peptides and two different adjuvants, CpG and Poly (I:C). NP were prepared by the double emulsion (w/o/w) solvent evaporation method, and all NP were characterized regarding their physicochemical properties, adjuvant entrapment efficiency (EE) and NP loading capacity (LC). All NP formulations, including empty and loaded NP, presented a narrow size distribution with an average size close to 200 nm with a polydispersity index (PdI) 0.2 nm. The NP did not impact the viability of DC cell line in the concentrations tested. The ability of the NP to induce DC maturation, and activate T cells was characterized in vivo. These studies showed the up-regulation of the CD80 and CD86 marker for migrating DC that internalized NP. However, no differences were observed with the combination of the two TLR agonists and mannose use. Moreover, it was observed an increase in the percentage of activated CD8+ T cells for immunized mice. This work presents an innovative approach to the treatment of CRC, highlighting the importance of nanotechnology to design nanonovaccines for cancer. | pt_PT |
| dc.identifier.tid | 202986454 | pt_PT |
| dc.identifier.uri | http://hdl.handle.net/10451/53033 | |
| dc.language.iso | eng | pt_PT |
| dc.subject | Colorectal cancer | pt_PT |
| dc.subject | Immunotherapy | pt_PT |
| dc.subject | Nanovaccine | pt_PT |
| dc.subject | Poly (i:c) | pt_PT |
| dc.subject | Cpg | pt_PT |
| dc.subject | Mestrado integrado - 2021 | pt_PT |
| dc.title | Dendritic cell regulation by a novel mannosylated nanovaccine | pt_PT |
| dc.type | master thesis | |
| dspace.entity.type | Publication | |
| rcaap.embargofct | Trabalho com dados relacionados com uma patente submetida. | pt_PT |
| rcaap.rights | restrictedAccess | pt_PT |
| rcaap.type | masterThesis | pt_PT |
| thesis.degree.name | Tese de Mestrado Integrado em Ciências Farmacêuticas | pt_PT |
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