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Publicação
Building bacterial multispecies biofilms as surface probiotics
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Autores
Orientador(es)
Resumo(s)
O problema crescente da bioincrustação, que se define como a acumulação indesejada de
microrganismos, algas e invertebrados em superfícies submersas, continua a desafiar diversas indústrias
marítimas, impactando infraestruturas de navegação e plataformas marítimas. As soluções de antibioincrustação tradicionais são, geralmente, à base de produtos químicos e de limpeza mecânica
frequente, apresentando eficácia limitada a longo prazo e levantando preocupações ambientais, devido
aos efeitos tóxicos nos ecossistemas marinhos. Consequentemente, existe um crescente interesse em
explorar soluções biotecnológicas que possam aproveitar mecanismos naturais para evitar a
bioincrustação de forma sustentável. Esta dissertação investiga uma potencial abordagem inovadora
para a prevenção da bioincrustação ao pesquisar a composição de um biofilme multiespécies, estável e
resistente à invasão biológica por Pseudoalteromonas tunicata que possa ser utilizado como
revestimento probiótico para superfícies expostas à atividade marinha.
A bioincrustação ocorre como um processo complexo e multifásico, envolvendo a colonização
de superfícies submersas por uma ampla gama de microrganismos. Inicialmente, proteínas,
glicoproteínas e outras moléculas orgânicas formam uma camada de condicionamento nessas
superfícies, criando um substrato adequado para a fixação bacteriana e a subsequente formação de
biofilmes. Os biofilmes, geralmente compostos por células microbianas incorporadas numa matriz de
substâncias poliméricas extracelulares (EPS), sustentam a adesão de organismos adicionais, como
diatomáceas e algas marinhas, que fornecem nutrientes para organismos maiores, como cracas e outros
macro-incrustantes. Essa sucessão biológica indica que o biofilme se encontra como a base que dá início
à bioincrustação, que contribui para a corrosão acelerada, aumento de arrasto em embarcações e custos
operacionais adicionais, tais como o consumo elevado de combustível.
Embora os biofilmes sejam geralmente considerados indesejáveis, alguns demonstram
qualidades protetoras que se refletem em ambientes marinhos. Certas estirpes bacterianas possuem
propriedades anti-bioincrustação, provavelmente devido à sua capacidade de competir ou inibir o
crescimento de espécies invasoras através de competição por recursos, secreção de compostos
inibitórios ou ocupação espacial. Esta descoberta levou à hipótese de que um biofilme bacteriano
multiespécies sintético poderia funcionar como um probiótico de superfície, estabelecendo um biofilme
benéfico que impede a colonização indesejada por meio da formação de uma comunidade microbiana
estável, biologicamente ativa e dinâmica.
O objetivo específico desta dissertação consistiu, assim, em investigar o potencial uso de um
biofilme multiespécies derivado de estirpes bacterianas marinhas para futuramente servir como um
revestimento anti-bioincrustação de materiais como o alumínio revestido com PSX700 e o policloreto
de vinil (PVC). Foram inicialmente selecionadas estirpes-chave pela sua capacidade de aderir
fortemente a superfícies sintéticas (mencionadas acima), tendo-se, de seguida, analisado a sua
resiliência contra a invasão da bactéria marinha P. tunicata, conhecida por produzir compostos
antimicrobianos. O estudo adota uma abordagem “bottom-up”, começando com o rastreio de 21 estirpes
marinhas individuais e seleção dos candidatos com a mais forte fixação às superfícies sintéticas. Seguiuse a montagem de estirpes candidatas em comunidades mistas com alta capacidade de adesão e
resistência à invasão.
As estirpes que apresentaram o melhor potencial de fixação foram testadas em cocultura para
analisar possíveis interações entre estirpes, para que, caso houvesse uma interação negativa, a estirpe
responsável fosse retirada do conjunto de estirpes. Em seguida, compôs-se uma comunidade bacteriana com três das estirpes escolhidas, especificamente H2, H3 e H5, para avaliação contra a invasão por P.
tunicata. Para visualizar e quantificar os eventos de invasão, P. tunicata foi geneticamente marcada
com uma proteína verde fluorescente (GFP) usando o sistema de transposões mini-Tn7. Este método
de marcação cromossómica permitiu a monitorização da invasão usando citometria de fluxo, uma
técnica que facilitou a quantificação das populações bacterianas individuais após a invasão. O pigmento
característico de cor preta produzida por P. tunicata facilitou a quantificação e diferenciação de colónias
bacterianas por determinação do título de unidades formadoras de colónias (CFU/mL).
O rastreio inicial de adesão identificou seis estirpes (H2, H3, H5, H11, H12 e H13) que exibiram
forte formação de biofilmes em superfícies de alumínio revestidas com PSX700, em contraste com o
controlo positivo (Vibrio anguillarum PF4). Essas estirpes aderiram consistentemente à superfície,
verificando-se baixa contagem de células planctónicas, o que indicou um alto nível de adesão. A robusta
formação de biofilmes por essas estirpes apoiou a sua seleção como candidatas para os ensaios de
invasão subsequentes e montagem de comunidades. Avaliou-se a abundância relativa de cada estirpe
após a invasão e as, diferenças na composição da comunidade entre amostras invadidas e não invadidas.
Foram realizadas comparações entre monoculturas, coculturas e comunidades multiespécies.
Quando testadas individualmente para resistência à invasão, as seis estirpes selecionadas
mostraram variabilidade na sua capacidade de resistir à invasão por P. tunicata. A estirpe H2 foi
completamente susceptível à invasão, enquanto H5 e H12 demonstraram resistência completa em todos
os testes. As estirpes H3, H11 e H13 exibiram resistência moderada e inconsistente, o que evidenciou
os desafios subjacentes à previsão do comportamento comunitário com base apenas em dados de
monocultura.
Após os ensaios de invasão das estirpes em monoculturas, um biofilme multiespécies foi
montado usando as estirpes H2, H3 e H5, escolhidas devido aos seus distintos perfis de resistência e
distinta taxonomia. Esta comunidade foi capaz de demonstrar resistência completa à invasão por P.
tunicata, que superou notavelmente a capacidade das estirpes individuais em monocultura de resistir à
invasão, e todas as combinações em cocultura. Notavelmente, a alta resistência de H5 em monocultura
foi bem traduzida no ambiente comunitário, proporcionando um efeito que contribuiu para a resiliência
geral da comunidade.
A comunidade montada com H2, H3 e H5 exibiu propriedades emergentes que não eram
aparentes em monocultura. A estirpe H2, que era altamente susceptível à invasão em monocultura,
continuou macroscopicamente indetectável no biofilme multiespécies, no entanto a sua presença na
comunidade impactou a proporção relativa dos membros da comunidade. Curiosamente, H3, que
mostrou resistência variável em monocultura, tornou-se mais resistente dentro da comunidade sob
condições de invasão. Enquanto H5 resistiu consistentemente à invasão, a abundância de H3 aumentou
em resposta à pressão de invasão na presença de H2, revelando uma resposta adaptativa dentro da
comunidade. Este resultado sugere que as interações entre espécies dentro da comunidade podem
conferir resiliência aumentada contra P. tunicata ao otimizar a partilha de recursos ou potenciar a
ocupação espacial e/ou outros comportamentos cooperativos.
As estirpes H2 e H3 em monocultura e cocultura foram expostas à invasão por P. tunicata
geneticamente marcada com GFP durante 1 h, 4 h e 20 h e analisadas por citometria de fluxo. O efeito
observado evidenciou que, quanto maior o tempo decorrido sobre a invasão, maior o impacto na redução
da população total, tanto em monocultura, como em cocultura, quando se compara com o grupo de
controlo (crescido nas mesmas condições, mas sem o ensaio de invasão). A redução marcada registada
após 20 h foi provavelmente devida à acumulação do agente antimicrobiano produzido por P. tunicata. Apesar de se ter registado uma maior diminuição da população total após 20 h, é possível verificar um
impacto notável logo após uma hora de invasão. Ou seja, um período de uma hora foi suficiente para se
analisar a capacidade da comunidade estudada resistir contra a invasão.
Enquanto a comunidade formada por H2, H3 e H5 apresentou resistência consistente contra a
invasão por P. tunicata, este estudo representa apenas um passo inicial no desenvolvimento de um
biofilme multiespécies robusto, com resistência sustentada contra diversos invasores. Como estudos
anteriores sugeriram, o aumento da diversidade da comunidade pode otimizar a utilização de nutrientes,
reduzir a disponibilidade de recursos para possíveis invasores e, assim, aumentar a resistência. Para se
alcançar um biofilme biologicamente ativo contra a bioincrustração é essencial o rastreio adicional de
bactérias marinhas com fortes capacidades de adesão e formação de biofilmes em superfícies revestidas
com PSX700 e em PVC. Estudos futuros poderão ampliar o conjunto de estirpes adequadas para uma
montagem de comunidades amplas, diversas e funcionalmente eficazes. O aumento progressivo da
diversidade de estirpes dentro da comunidade multiespécies, com um foco na sua estabilidade, adesão
e resistência à invasão, será crucial para formar um biofilme com resiliência e aplicabilidade de amplo
espectro.
Além disso, é imperativo avaliar a resistência destes biofilmes a vários estressores ambientais,
incluindo disponibilidade variável de nutrientes, flutuações de temperatura, mudanças de pH e
exposição prolongada à invasão em condições de fluxo, para simular os desafios dinâmicos do ambiente
marinho adverso. A otimização contínua de protocolos e o refinamento de ensaios baseados em
citometria de fluxo serão essenciais para quantificar e analisar com precisão a invasão e a dinâmica da
comunidade. Globalmente, este projeto serviu como um passo fundamental rumo a uma solução
sustentável e ecologicamente balanceada para o controlo da bioincrustação, aproveitando biofilmes
multiespécies como um potencial probiótico para revestimento de superfícies sintéticas. A abordagem
delineada neste trabalho pode ter aplicações significativas em indústrias onde a bioincrustação continua
a ser um desafio, abrindo novos caminhos de investigação para o desenvolvimento de revestimentos
com aplicações marinhas e industriais.
Biofouling is the accumulation of unwanted growth of microorganisms and invertebrates on marine surfaces, leading to increased corrosion, drag, fuel consumption in vessels, and shortened lifespan of submerged structures. Conventional methods like antibiotics, toxic chemicals, and physical scraping offer only temporary solutions and come with environmental and economic drawbacks. These issues underscore the need for environmentally safe and cost-effective biofouling control methods. Given that marine biofilms play a foundational role in biofouling formation, an engineered, stable, invasion-resistant multispecies biofilm derived from marine strains could serve as a probiotic coating for submerged surfaces that prevent biofouling. The aim was to screen suitable marine strains to form a multispecies biofilm capable of resisting invasion by Pseudoalteromonas tunicata. In this study, a bottom-up approach was used to assemble a multispecies biofilm, beginning with screening 21 marine strains for their adhesion to synthetic surfaces such as PPG PSX® 700 and PVC coupons. The strains with the best adhesion were then tested against invasion by P. tunicata. Six strains showed strong adhesion, though varied in invasion resistance, leading to the assembly of a multispecies community with strains differing in sensitivity to invasion. The assembled community was composed of isolates/strains H2, H3, and H5 and demonstrated high invasion resistance, surpassing that of individual strains in monoculture. The H3 and H5 played key roles in the community’s invasion resistance success. A biofilm invasion assay revealed that a 1 h period of invasion was enough to show reduction of total cells and longer invasion times were not needed to prove the community 's capability of resisting invasion. These findings are promising, indicating that even a three-strain multispecies biofilm community can resist invasion effectively. This study marks an initial step toward harnessing stable, invasion-resistant biofilms as a sustainable biofouling control method, with potential applications for diverse material surfaces and environments.
Biofouling is the accumulation of unwanted growth of microorganisms and invertebrates on marine surfaces, leading to increased corrosion, drag, fuel consumption in vessels, and shortened lifespan of submerged structures. Conventional methods like antibiotics, toxic chemicals, and physical scraping offer only temporary solutions and come with environmental and economic drawbacks. These issues underscore the need for environmentally safe and cost-effective biofouling control methods. Given that marine biofilms play a foundational role in biofouling formation, an engineered, stable, invasion-resistant multispecies biofilm derived from marine strains could serve as a probiotic coating for submerged surfaces that prevent biofouling. The aim was to screen suitable marine strains to form a multispecies biofilm capable of resisting invasion by Pseudoalteromonas tunicata. In this study, a bottom-up approach was used to assemble a multispecies biofilm, beginning with screening 21 marine strains for their adhesion to synthetic surfaces such as PPG PSX® 700 and PVC coupons. The strains with the best adhesion were then tested against invasion by P. tunicata. Six strains showed strong adhesion, though varied in invasion resistance, leading to the assembly of a multispecies community with strains differing in sensitivity to invasion. The assembled community was composed of isolates/strains H2, H3, and H5 and demonstrated high invasion resistance, surpassing that of individual strains in monoculture. The H3 and H5 played key roles in the community’s invasion resistance success. A biofilm invasion assay revealed that a 1 h period of invasion was enough to show reduction of total cells and longer invasion times were not needed to prove the community 's capability of resisting invasion. These findings are promising, indicating that even a three-strain multispecies biofilm community can resist invasion effectively. This study marks an initial step toward harnessing stable, invasion-resistant biofilms as a sustainable biofouling control method, with potential applications for diverse material surfaces and environments.
Descrição
Tese de Mestrado, Microbiologia Aplicada, 2025, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências
Palavras-chave
Biofilme Bioincrustação Revestimento de surperfície Comunidade multispécie Invasão Teses de mestrado - 2025