Development of cranberry extract films for the enhancement of food packaging antimicrobial properties

Severo, Catarina Monteiro

http://hdl.handle.net/10451/43196

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Authors

Severo, Catarina Monteiro

Advisor(s)

Silva, Isabel Alexandra Caldeira Ribeiro Monge da

Bettencourt, Ana Francisca Campos Simão

Abstract(s)

A formação de biofilmes por bactérias patogénicas é motivo de grande preocupação para a indústria alimentar visto que várias bactérias têm a capacidade de aderir a superfícies que entram em contacto com alimentos e formar biofilmes. A formação de biofilmes faculta a estas bactérias uma maior resistência a condições ambientais e tratamentos, o que compromete a segurança e qualidade dos alimentos. Atualmente existem algumas estratégias de controlo desde problema, tais como tratamentos químicos para prevenir a formação de biofilmes. No entanto, há um problema crescente de resistência de estirpes que diminuem a eficácia dos métodos convencionais. Assim, nos últimos anos, tem existido um maior atenção para o desenvolvimento de novas estratégias de prevenção e controlo de biofilmes, particularmente, no desenvolvimento de embalagens inteligentes e ativas capazes de incorporar agentes antimicrobianos no material da embalagem tais como nano materiais, biossurfactantes e inibidores de quorum-sensing. Nos últimos tempos, os frutos vermelhos têm ganho uma relevância particular devido ao seu alto conteúdo em compostos bioativos. O fruto arando, especificamente, é associado a vários efeitos benéficos para a saúde humana tais como proteção de doenças cardiovasculares, diminuição de infeções do trato urinário e prevenção de danos oxidativos devido ao seu alto conteúdo em compostos fenólicos que revelam ter várias propriedades bioativas, tais como propriedades anti-inflamatórias, antioxidantes e antimicrobianas. Por parte dos consumidores, existe também uma maior preocupação para o desenvolvimento de embalagens alimentares sustentáveis, que possam substituir os plásticos sintéticos, caracterizados por grandes períodos de degradação. Deste modo, os bioplásticos, em especial os biodegradáveis, surgem como uma alternativa. O quitosano, é um polímero que tem tido grande destaque pelo seu potencial de aplicação em embalagens alimentares devido à sua atividade antimicrobiana e capacidade de formação de filmes. Filmes à base de quitosano têm sido produzidos especialmente incorporados com outros compostos antimicrobianos e têm comprovado melhorarem o tempo de vida e reduzir a contaminação dos alimentos sobre os quais são aplicados. A produção de embalagens biodegradáveis incorporadas com agentes antimicrobianos apresenta-se assim como uma solução para a melhoria da qualidade e segurança dos alimentos. Assim, o principal objetivo deste trabalho foi desenvolver um filme incorporado com extratos de arando destinado à aplicação em embalagens alimentares e estudar os seus efeitos antimicrobianos contra a formação de biofilme bacteriano. Desta forma, o estudo foi principalmente distribuído em três partes fundamentais: i) caracterização e extração de arandos sob diferentes formas de apresentação; ii) desenvolvimento e otimização de filmes de quitosano; iii) funcionalização de filmes de quitosano com incorporação de extratos de arando. Foram assim utilizadas três fontes diferentes de arando, nomeadamente arando fresco, arando em pó e arando desidratado, e com base na determinação de compostos fenólicos totais e análises de cromatografia líquida de alta eficiência foram escolhidas as melhores condições para a extração de compostos bioativos. De seguida, foram avaliadas as propriedades antimicrobianas (Concentração inibitória mínima (CIM), Concentração bactericida mínima (CBM), Concentração inibitória mínima de formação de biofilme (CIMB)), o conteúdo fenólico total e a capacidade antioxidante (método de sequestro de radicais livres DPPH) dos extratos de arando. Os filmes à base de quitosano foram desenvolvidos, otimizados e as suas propriedades físicas e mecânicas foram avaliadas através de vários ensaios, tais como solubilidade total, conteúdo em humidade, capacidade de absorção de água, grau de molhabilidade, transmissão de luz, transparência, dureza, permeabilidade ao vapor de água e taxa de transmissão de oxigénio. Após incorporação dos extratos de arando, as propriedades antimicrobianas dos filmes foram também avaliadas através do método de difusão em agar e as propriedades antibiofilme foram avaliadas através do método de contagem de colónias e por observação de imagens ao microscópio eletrónico de varrimento. Os resultados demonstraram que todos os extratos de arando apresentaram capacidade antimicrobiana contra Escherichia coli ATCC 25922 e Staphylococcus aureus ATCC 25923 e também propriedades antioxidantes, particularmente os extratos de arando fresco e arando em pó. Ambos os extratos de arando fresco e arando em pó apresentam uma CIM de 3,1 mg/mL para S. aureus e 6,3 mg/mL para E. coli. Adicionalmente, os extratos de arando fresco e arando em pó demonstraram propriedades antibiofilme contra ambas as bactérias, obtendo-se valores de CIMB contra S. aureus e E. coli, em ambos os extratos, de respetivamente 6,3 mg/mL e de 25 mg/mL. Foi importante testar a capacidade antimicrobiana dos extratos contra estas duas bactérias, visto serem duas bactérias patogénicas frequentemente associadas a surtos de origem alimentar, com capacidade de aderir a várias superfícies da indústria alimentar e formar biofilmes. O conteúdo total em compostos fenólicos dos extratos de arando variou entre 1,4 ± 0,2 a 106,3 ± 13,2 mg Ácido Gálico/ g extrato de arando, sendo que os extratos de arando em pó e arando fresco obtiveram os valores mais altos de conteúdo em compostos fenólicos. Relativamente à atividade antioxidante, foi possível determinar que os extratos em arando desidratado obtiveram os valores mais baixos de capacidade de sequestro de radicais livres DPPH enquanto o extrato de arando em pó demonstrou uma maior de atividade antioxidante, relativamente aos restantes. Adicionalmente, os compostos fenólicos presentes no extrato de arando fresco foram determinados através de LC-MS/MS e foi possível identificar a presença de nomeadamente isoramnetina-3-glucósido, florizina, ácido hidroxibenzóico, epicatequina e ácido clorogénico. Foi também possível assumir a presença de dímeros de procianidinas A, frequentemente associadas a propriedades antimicrobianas. Deste modo, o extrato arando fresco e arando em pó foram considerados os mais adequados para incorporação nos filmes em desenvolvimento. Inicialmente, foi observado que os filmes desenvolvidos com uma combinação de quitosano de alto peso molecular e quitosano de médio peso molecular obtinham melhores resultados relativamente aos filmes apenas desenvolvidos com um tipo de massa molecular de quitosano, os quais se apresentavam mais frágeis. Desta forma, foram selecionados para os seguintes ensaios, os filmes 1% + 2%, 0,5% + 2% e 1,5% + 1,5% de quitosano de médio peso molecular e quitosano de alto peso molecular, respetivamente, combinados com o plastificante polietilenoglicol (PEG) ou com PEG e glicerol. As propriedades físicas dos filmes selecionados apresentaram resultados semelhantes, no entanto, foi verificado que os filmes 0,5% + 2% apresentaram um conteúdo mais baixo em humidade, menor solubilidade e menor grau de molhabilidade. Com base nestes resultados, filmes preparados com 0,5% + 2% de quitosano de médio peso molecular e de alto peso molecular respetivamente (com e sem adição de glicerol) foram selecionados para ensaios com incorporação de extrato de arando visto que não se observaram diferenças evidentes nos filmes nos restantes ensaios, respetivamente propriedade de transmissão de luz, transparência e ensaios antimicrobianos. O grau de molhabilidade dos filmes aumentou após incorporação dos extratos de arando, foi observado um aumento da opacidade e redução de transmissão de luz e os filmes mantiveram as suas propriedades antimicrobianas. Nos filmes incorporados com extratos de arando, foi observado uma redução da formação de biofilme de E. coli e S. aureus na superfície testada e esta redução aumentou com o aumento da concentração de extrato de arando presente no filme. Através do método de contagem de colónias também foi possível observar que os filmes preparados à base de quitosano levaram a uma diminuição da formação de biofilme na superfície testada, tanto para S. aureus como E. coli, e ainda que essa redução foi superior nos filmes preparados com extrato de arando. Nos filmes com extrato de arando observou-se uma redução superior a unidades 2 log comparativamente com o controlo. Foi demonstrado também que uma maior concentração de extrato de arando nos filmes leva a uma maior redução da formação de biofilme. As imagens obtidas por microscopia eletrónica permitiram observar que nas superfícies dos filmes sem extrato de arando há uma formação significativa de colónias de S. aureus enquanto nos filmes com extrato de arando, tanto com 100 mg/mL de extrato como 200 mg/mL, há uma ausência de formação de colónias. De um modo geral, os resultados apresentados neste estudo revelam a capacidade de desenvolvimento de filmes de extrato de arando com propriedades antimicrobianas e antibiofilme, demonstrando deste modo, um potencial de aplicação em embalagens alimentares. O desenvolvimento de embalagens ativas torna-se cada vez mais importante na indústria alimentar, para assegurar a segurança do consumidor e a qualidade do produto prevenindo a contaminação dos produtos através da redução e inibição do crescimento de microrganismos. Deste modo, os resultados deste estudo apontam para uma estratégia que pode ser explorada para utilização em embalagens alimentares, demonstrando também a capacidade dos compostos bioativos de arando no controlo da propagação de microrganismos. Mais estudos devem ser realizados para aperfeiçoamento das propriedades dos filmes, nomeadamente a melhoria das propriedades físicas e potenciação da atividade antimicrobiana através de uma combinação com outros compostos antimicrobianos. Novos estudos devem igualmente ser feitos relativamente à estabilidade em condições de conservação alimentar e observação do efeito e segurança destes filmes no contacto direto com produtos alimentares.

Numerous outbreaks of foodborne pathogens have been found to be associated with biofilms, which poses a concern to the food industry since foodborne pathogens and their biofilm can adhere to a wide range of food contact materials. There are current strategies to control this problem such as chemical treatments to prevent biofilm formation, however, there has been an arising problem of resistant strains that decreased the effectiveness of these conventional methods. Thus, there is a need for the development of novel strategies that can control biofilm formation, especially regarding smart and intelligent packaging systems able to incorporate antimicrobial agents into the packaging material. Berries are suggested to have numerous health benefits for humans due to its high content in phenolic compounds, especially flavonoids. These polyphenolic antioxidants prove to have various biological activities such as anti-inflammatory and antimicrobial properties. Thus, the main aim of this research was to develop a biodegradable film incorporated with cranberry extracts intended for food packaging and to study the film antimicrobial impact against some biofilm forming bacteria. The study started by evaluating the antimicrobial properties (Minimum Inhibitory Concentration (MIC), Minimum Bactericidal Concentration (MBC) and Minimum Biofilm Inhibitory Concentration (MBIC)), the total phenolic content and the antioxidant capacity (DPPH radical scavenging activity) of cranberry extracts from three different cranberry sources, respectively fresh, powdered and dried cranberries. Then, chitosan based films were developed, optimized and their physical and mechanical properties were evaluated through several analysis such as Total Soluble Matter (TSM), moisture content, swelling degree, surface wettability degree, light-barrier properties, hardness values, water vapour permeability and oxygen transmission rate. After cranberry extracts incorporation, films antimicrobial properties were tested through a disk diffusion assay and films antibiofilm properties were tested by the plate counting method and by scanning electron microscopy. The results showed that all cranberry extracts presented antimicrobial properties against Escherichia coli ATCC 25922 and Staphylococcus aureus ATCC 25923 and antioxidant properties. Fresh and powdered cranberries extracts showed the highest antimicrobial properties. Both extracts had a MIC against S. aureus and E. coli of 3.1 and 6.3 mg/mL, respectively. These extracts also demonstrated antibiofilm properties against both strains, having both extracts a MBIC of 6.3 and 25 mg/mL against S. aureus and E. coli, respectively. The total phenolic content from cranberry extracts ranged from 1.4 ± 0.2 to 106.3 ± 13.2 mg Gallic Acid eq/g cranberry extract with powdered and fresh cranberry extracts having the higher total phenolic content results. From the DPPH radical scavenging method, it was possible to determine that dried cranberry extracts had the lowest scavenging capacity and powdered cranberry revealed the highest scavenging capacity. Additionally, in fresh cranberry extracts, it was possible to identify by LC-MS/MS the presence of different phenolic compounds (i.e. isorhamnetin 3-glucoside, phloridzin, p-hydroxybenzoic acid, epicatechin and chlorogenic acid) and to assume the presence of A-type procyanidin dimers, widely associated to anti-adhesion properties. Thus, fresh and powdered cranberry extracts were considered to be the more suitable cranberry extracts for incorporation into the developing films. After films optimization, evaluation of the films physical properties demonstrated similar results between the three different chosen chitosan mixtures, however, films prepared with 0.5% medium molecular weight chitosan and 2% high molecular weight chitosan showed a higher potential to resist to water. After cranberry extracts incorporation, films wettability degree increased, films light-barrier properties improved and films showed antimicrobial properties against both S. aureus and E. coli. Furthermore, in films with cranberry extracts incorporation, it was also observed a reduction of E. coli and S. aureus biofilm formation on the tested surface. The antibiofilm properties also showed to improve with the increase of cranberry extract concentration in the chitosan films and a reduction higher than 2 log units could be observed with cranberry film samples when compared to the positive control. Overall, the investigation revealed the potential of cranberry extract films for the improvement of food packaging material antimicrobial properties.