Publicação
Validation and further characterization of Pseudomonas aeruginosa genes putatively involved in modulating multidrug resistance
| datacite.subject.fos | Ciências Médicas | pt_PT |
| dc.contributor.advisor | Bohn, Erwin | |
| dc.contributor.advisor | Ramirez, Mário Nuno Ramos d’Almeida | |
| dc.contributor.author | Pereira, Sara Cristina Fragata | |
| dc.date.accessioned | 2023-11-21T14:53:56Z | |
| dc.date.available | 2023-11-21T14:53:56Z | |
| dc.date.issued | 2023-05 | |
| dc.description | Tese de mestrado, Microbiologia Clínica e Doenças Infeciosas Emergentes, Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2023 | pt_PT |
| dc.description.abstract | Pseudomonas aeruginosa (Pa) é uma bactéria Gram-negativa, anaeróbica facultativa, que é ubíqua no ambiente e capaz de causar doenças não só em seres humanos, mas também em animais e plantas. Pa é uma das espécies patogénicas nosocomiais mais relevantes, com a importância crescente das infecções causadas por estirpes multirresistentes. Esta espécie apresenta resistência a uma variedade de antibióticos, tais como antibióticos betalactâmicos, aminoglicosídeos e quinolonas, sendo que a resistência a múltiplos agentes antimicrobianos tem vindo a aumentar substancialmente nos últimos anos. Os genes amgK, anmK, bepA, murU, mupP e ycgE2 foram identificados através da análise de TraDIS descrita em Sonnabend et al. (2020). A identificação destes genes foi feita numa estirpe isolada em contexto clínico, a partir da corrente sanguínea, caracterizada como multirresistente, e denominada como Pa ID40 (estirpe wild-type, WT). (Willmann et al. 2019) Esta estirpe (Pa ID40) foi a utilizada ao longo deste trabalho, salvo indicação em contrário. A aplicação da técnica TraDIS permitiu a identificação de genes alvo (onde se incluem os genes em estudo nesta tese) com um possível envolvimento na capacidade desta estirpe resistir aos antimicrobianos. Os genes amgK, anmK, mupP e murU estão envolvidos na via de reciclagem de peptidoglicano. Esta via que reutiliza uma grande parte dos fragmentos resultantes da degradação da camada de peptidoglicano, constitui um novo alvo importante para terapêuticas antimicrobianas. (Dhar et al. 2018) O gene bepA, codifica a proteína BepA, uma zinco-metalopeptidase periplasmática, envolvida na manutenção da integridade da membrana externa e transporte de lipopolisacáridos. (Akiyama et al. 2021) Tendo isto em consideração, e de modo a validar a identificação dos genes encontrados pela análise do TraDIS, bem como determinar a sua relevância e potencial papel na resistência a diversos antimicrobianos, procedeu-se à geração de mutantes de deleção Pa ID40 DbepA, DmurU, DmupP e DycgE2. Para gerar os mutantes de deleção, em primeiro lugar, foi aplicada a clonagem de Gibson com recurso ao plasmídeo pexG2 e digestão com DpnI. Em seguida, foram realizadas transformações primeiro em TOP10 E. coli e depois em SM10 λ pir E. coli. Por fim, foi realizada a conjugação em Pa ID40 seguida de contra-seleção, e vários PCRs foram feitos para validar o processo de mutação. É relevante, no entanto, referir que a geração dos mutantes Pa ID40 DanmK e DamgK foi realizada independente deste estudo. De forma a atingir o objetivo definido, a caracterização dos mutantes de deleção é fundamental. Assim, a importância dos genes amgK, anmK, bepA, murU, mupP e ycgE2 no padrão de crescimento foi determinada através da realização de curvas de crescimento em LB e em meio mínimo M9, durante um período de 36 horas. A análise destes resultados demonstrou a ausência de diferenças significativas entre as estirpes com mutação e a estirpe Pa ID40 WT. De forma a investigar a forma como os genes em causa modulam a resistência em Pa, foram estabelecidas as concentrações inibitórias mínimas (MICs) para um conjunto de diferentes antimicrobianos, nomeadamente beta-lactâmicos, fosfomicina e polimixina B. Para tal foram utilizadas as placas disponíveis comercialmente, “GN2F” e “EUX2NF” da Thermofisher, e “MICRONAUTS ß-Lactamases” da Merlin. Os resultados mostraram uma redução de MIC para entre metade a um terço para a maioria dos beta-lactâmicos nas estirpes ID40 DanmK, DamgK, DmupP, DmurU e DbepA em comparação com a estirpe WT. Do mesmo modo, resultados idênticos foram observados para a fosfomicina. Por outro lado, ao analisar os resultados das MICs da polimixina B pudemos observar uma redução de MIC para metade nas estirpes ID40 DamgK e DbepA, em comparação com a estirpe WT. Efluxo é um processo utilizado por inúmeros organismos para diminuir a susceptibilidade a compostos tóxicos, tais como os antibióticos. Desta forma, para determinar se a diminuição de resistência observada nos mutantes, aquando da análise dos resultados da determinação das MICs, poderia ter origem em alterações na atividade das bombas de efluxo, a realização de ensaios de efluxo para todos os mutantes é fundamental, tendo sido por isso o próximo passo executado. Este ensaio teve como base o uso de um corante fluorescente, designadamente Hoechst 33342. Subsequentemente à sua entrada na célula, este corante cria uma ligação ao ADN de dupla cadeia, funcionando ao mesmo tempo como um substrato de várias bombas de efluxo. Assim, espera-se que o sinal luminescente detectado aquando da ligação de Hoechst 33342 reflita a proporção de influxo e efluxo. Os dados obtidos, no entanto, não revelaram quaisquer diferenças significativas entre os mutantes de deleção e a estirpe WT. Paralelamente, e uma vez que a deleção dos genes levou a uma diminuição da resistência a beta-lactâmicos, procedeu-se à medição da actividade da beta-lactamase. A atividade desta enzima foi medida recorrendo ao kit da companhia BioVision com o nome de “β-Lactamase Colorimetric Assay Kit”, que se baseia na quantificação de um produto da reação da hidrólise da nitrocefina, uma cefalosporina cromogénica. Estes ensaios, por sua vez, revelaram uma diminuição de 20 % a 70 % da actividade de beta-lactamase para todos os mutantes, quando comparados com a estirpe WT. Posteriormente, a expressão de ampC foi determinada de modo a avaliar se a redução de actividade se deveria ao envolvimento dos genes em estudo na regulação transcricional da beta-lactamase AmpC, uma cefalosporinase cromossómica, com um papel major em conferir multirresistência em Pa. A análise da expressão de ampC foi, portanto, executada através de múltiplas reacções em cadeia da polimerase, quantitativas e em tempo real de transcrição reversa (qRT-PCR). Adicionalmente, a ausência de contaminação por ADN foi previamente estabelecida através da execução da reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR), amplificando o gene conservado gyrB. Estes resultados mostraram que as estirpes mutantes têm um nível de expressão semelhante ao da estirpe WT, não sendo, por isso, mudanças de expressão a causa das alterações na actividade da beta-lactamase. O sistema do complemento constitui a primeira linha de defesa imune, e é constituído por uma rede de proteínas plasmáticas que desencadeiam uma cascata proteolítica aquando do reconhecimento de certos padrões microbianos. Tendo isto em consideração, as bactérias são capazes de usar várias estratégias para obter resistência sérica. Uma vez que a estrutura do lipopolissacárido, relacionada com a resistência à polimixina B, é importante para alcançar a resistência sérica, especulou-se que a deleção de amgK poderia afetar a resistência sérica. Assim, o ensaio de morte sérica foi realizado, não tendo sido, no entanto, observadas diferenças entre o mutante de deleção amgK e a estirpe WT. Uma vez que a mesma diferença de MIC foi observada para bepA e para amgK, e considerando as funções de BepA, seria relevante realizar este ensaio com um mutante com deleção de bepA. Porém, devido a constrangimentos de tempo, não foi possível fazê-lo neste estudo. No seu conjunto, estes resultados permitem a obtenção de diversas conclusões. Primeiramente, os genes estudados não afetam a capacidade de crescimento em condições normais de laboratório. Mais, os genes anmK, amgK, mupP, murU e bepA contribuem para a resistência a beta-lactâmicos e fosfomicina e os genes amgK e bepA contribuem para a resistência à polimixina B. Verifica-se então que os genes amgK, anmK, mupP e murU, todos eles genes envolvidos na via de reciclagem de peptidoglicano, modulam a resistência antimicrobiana. Isto é indicativo da relevância da via de reciclagem do peptidoglicano na resistência antimicrobiana. Os resultados obtidos permitiram ainda concluir que o gene bepA também modula a resistência antimicrobiana, o que é pertinente visto que a proteína codificada por este gene tem um papel importante em manter a integridade da membrana externa assim como em transportar lipopolissacáridos para a mesma. Concluiu-se também que a modulação de resistência, observada na análise das MICs das estirpes com deleção dos genes em estudo, é independente da atividade de efluxo/influxo. Pelo contrário, concluiu-se que a modulação da resistência está relacionada com a atividade de beta-lactamase, que foi afectada em todos os genes estudados. No entanto, a expressão de ampC não parece ser afectada nas estirpes mutantes. Assim, a forma como os genes anmK, amgK, mupP, murU e bepA estão envolvidos na regulação da actividade da beta-lactamase e o mecanismo através do qual eles modulam a resistência não estão ainda esclarecidos. | pt_PT |
| dc.description.abstract | Pseudomonas aeruginosa, a Gram-negative bacteria, is one of the most relevant nosocomial pathogens. Pa’s multidrug resistance has recently increased substantially. The genes amgK, anmK, bepA, murU, mupP and ycgE2 were identified in the TraDIS screen described in Sonnabend et al.. To validate the identification of these genes and investigate their relevance in antibiotic resistance we generated Pa ID40 DbepA, DmurU, DmupP and DycgE2. We investigated whether the deletion of amgK, anmK, bepA, murU, mupP and ycgE2 affected growth by performing growth curves. No significant differences were observed. To understand how the genes modulate resistance, minimal inhibitory concentrations were assessed: a reduction of 1- to 3-fold was observed for most beta-lactams and fosfomycin in DanmK, DamgK, DmupP, DmurU and DbepA; and 2-fold for polymyxin B in DamgK and DbepA, in comparison to ID40. To determine if the decreased MICs are due to alterations of efflux pumps activity, activity efflux assays were performed for all mutants, where no differences to the WT were observed. Since the genes lead to increased beta-lactam resistance, betalactamase activity was assayed, and all mutants showed a decrease. To understand the gene’s involvement in transcriptional regulation of AmpC, ampC expression was measured, being close (~ 1-fold) to the WT for all mutants. Because of the polymyxin B MIC reduction for DamgK, a serum killing assay was performed, and no differences between ID40 DamgK and WT were observed. The studied genes don’t affect bacterial fitness. anmK, amgK, mupP, murU and bepA modulate resistance by increasing beta-lactam and fosfomycin resistance and amgK and bepA by increasing polymyxin B resistance. Efflux/influx isn’t involved in modulating resistance in the studied genes. All studied genes lead to increased beta-lactamase activity. How anmK, amgK, mupP, murU and bepA are involved in regulation of AmpC and the mechanism through which they modulate resistance remains unclear. | pt_PT |
| dc.identifier.tid | 203285735 | pt_PT |
| dc.identifier.uri | http://hdl.handle.net/10451/60709 | |
| dc.language.iso | eng | pt_PT |
| dc.subject | Pseudomonas | pt_PT |
| dc.subject | Antimicrobiano | pt_PT |
| dc.subject | Resistência | pt_PT |
| dc.subject | Peptidoglicano | pt_PT |
| dc.subject | Beta-lactamase | pt_PT |
| dc.subject | Teses de mestrado - 2023 | pt_PT |
| dc.title | Validation and further characterization of Pseudomonas aeruginosa genes putatively involved in modulating multidrug resistance | pt_PT |
| dc.type | master thesis | |
| dspace.entity.type | Publication | |
| rcaap.rights | openAccess | pt_PT |
| rcaap.type | masterThesis | pt_PT |
| thesis.degree.name | Mestrado em Microbiologia Clínica e Doenças Infeciosas Emergentes | pt_PT |