Publicação
Sparkling wine yeasts performance: integrated characterization during second fermentation
| dc.contributor.advisor | Tenreiro, Ana Maria Moura Pires de Andrade, 1952- | |
| dc.contributor.author | Ferreira, David José Moreira, 1988- | |
| dc.date.accessioned | 2014-01-17T19:40:05Z | |
| dc.date.available | 2014-01-17T19:40:05Z | |
| dc.date.issued | 2013 | |
| dc.description | Tese de mestrado [versĂŁo pĂșblica]. Biologia (Microbiologia aplicada). Universidade de Lisboa, Faculdade de CiĂȘncias, 2013 | por |
| dc.description.abstract | Sparkling wines are a distinguĂ© type of wine, very appreciated worldwide and with an important market value. Their production is based on a second alcoholic fermentation of a base wine. Invariably, Saccharomyces cerevisiae is chosen by wine-makers to perform such fermentation due to its unmatched qualities. Second fermentation process is associated to particular stress factors with which yeasts must cope. Ethanol presence (8-14%), temperatures below 16ÂșC or nitrogen starvation are among unfavorable conditions yeast must support and that ultimately can compromise the fermentation, delivering an unsatisfactory final product. The objective of this work was to study encapsulated sparkling wine yeastsâ physiological, cytological and molecular adaptation during an in-bottle process of second fermentation at very low temperatures and different concentrations of assimilable nitrogen. Two yeast strains were inoculated in conventional sparkling wine bottles at two different temperatures (10ÂșC and 12ÂșC) with two different assimilable nitrogen concentrations (100 mg/l and 56 mg/l), generating 8 fermentation conditions that mimic an actual industrial sparkling wine production. In order to study the physiological changes along the process an integrative and multiparametic characterization was made at specific time-points. For the purpose several yeast parameters were monitored: fermentation kinetics, viability, vitality, glycogen, trehalose, neutral lipids, glutathione, fatty acids, total proteins, ATP, relative expression of targeted stress genes and sensorial properties. Lower temperatures and low nitrogen showed to have a major impact on fermentation, with an influence on evaluated parameters and wine sensorial quality that was highly strain dependent. Strain SC1 was more robust, resilient and well-adapted to 10ÂșC fermentations, whereas strain SC2 revealed to be more active and plastic, producing higher quality wines at 12ÂșC. With the information gathered in this work, profitable adjustments in yeast production process are certainly expected, as well as design of new plans of study encompassing different strains and/or additional parameters. | por |
| dc.description.abstract | Os vinhos efervescentes sĂŁo um tipo de vinho que se destaca pelas suas caracterĂsticas Ășnicas, muito apreciado mundialmente e com um considerĂĄvel valor de mercado. O exemplar de excelĂȘncia deste tipo de vinhos Ă© o Champagne, produzido exclusivamente na regiĂŁo de Champagne, França e que Ă© conhecido pelo seu enorme prestĂgio e paladar Ășnico. O processo de produção de um vinho efervescente passa pela realização de uma segunda fermentação alcoĂłlica a partir de um vinho base, normalmente branco ou rosĂ©. Este vinho base Ă© obtido a partir de uma fermentação alcoĂłlica em mosto da mesma forma que um vinho de mesa seria obtido. A principal diferença reside na adição posterior de vĂĄrios compostos ao vinho base que irĂŁo ajudar a que a segunda fermentação decorra da melhor forma. Um concentrado de sacarose (tambĂ©m chamado de liqueur de tirage), azoto assimilĂĄvel, taninos ou bentonite sĂŁo exemplos de alguns aditivos que tĂȘm por função nĂŁo sĂł facilitar o processo fermentativo mas tambĂ©m contribuir para o seu sucesso. No centro de todo o processo estĂĄ o microrganismo responsĂĄvel pela segunda fermentação. Invariavelmente Saccharomyces cerevisiae Ă© a levedura escolhida pelos produtores de vinhos efervescentes. Hoje em dia existem centenas de estirpes industriais, que foram sendo seleccionadas ao longo dos anos pelas suas caracterĂsticas especĂficas, e sĂŁo sem dĂșvida as mais aptas a realizar um processo tĂŁo exigente como o de segunda fermentação. Estas leveduras podem ser comercializadas sob vĂĄrias formas como sĂŁo exemplo as culturas lĂquidas e as leveduras secas activas, estas Ășltimas subdivididas em livres ou encapsuladas. As leveduras encapsuladas foram recentemente introduzidas no mercado pela Proenol, uma empresa portuguesa que Ă© neste momento lĂder mundial de mercado nesta ĂĄrea. Este tipo de leveduras apresenta vĂĄrias vantagens sobre as outras formas, nomeadamente a eliminação do passo de sedimentação progressiva da levedura anterior Ă sua remoção e a possibilidade de inoculação directa (sem aclimatização), tudo sem que a levedura ou a qualidade do vinho sejam afectados. A aclimatização Ă© um processo pelo qual as leveduras sĂŁo gradualmente adaptadas Ă s condiçÔes adversas que vĂŁo encontrar no vinho base quando forem inoculadas, como por exemplo a presença de etanol (8-11%) e baixas temperaturas (inferior a 16ÂșC). Ambos os processos mencionados (sedimentação progressiva da levedura e aclimatização) sĂŁo demorados, dispendiosos e requerem trabalho extra, o que faz com que as leveduras encapsuladas sejam bastante atraentes para os produtores de vinho. Existem vĂĄrios mĂ©todos pelos quais um vinho efervescente pode ser produzido, no entanto, o mĂ©todo tradicional (ou mĂ©thode traditionnelle) Ă© conhecido por ser o mĂ©todo com o qual se conseguem produzir vinhos efervescentes de qualidade superior sendo desta forma o preferido por muitos produtores. Neste mĂ©todo, o fermentador utilizado Ă© a prĂłpria garrafa que mais tarde serĂĄ entregue ao consumidor final. Assim, garrafas contendo o vinho base sĂŁo inoculadas com levedura, rolhadas e deixadas a fermentar em extensas caves ou adegas, o que pode levar cerca de um a dois meses dependendo das condiçÔes de fermentação. ApĂłs este perĂodo, o vinho Ă© deixado em contacto com o depĂłsito de leveduras num processo chamado de âenvelhecimentoâ que pode ir de 9 meses a vĂĄrios anos consoante a variedade de vinho que esteja a ser produzida. Apesar de a fermentação jĂĄ ter terminado Ă© nesta fase que o vinho adquire as suas principais qualidades organolĂ©pticas. AminoĂĄcidos, manoproteĂnas e Ă©steres entre outros componentes celulares, sĂŁo lentamente libertados para o vinho e vĂŁo ser responsĂĄveis por apurar o aroma, paladar e o bouquet muito importantes neste tipo de vinhos. Finalmente, as garrafas sĂŁo invertidas verticalmente, a levedura deposita e Ă© removida por congelamento do gargalo da garrafa (dĂ©gorgement). ApĂłs o vinho final ser ajustado, as garrafas sĂŁo novamente rolhadas, rotuladas e estĂŁo prontas para chegar ao consumidor final. Apesar de o processo de segunda fermentação ser vastamente conhecido e aplicado hĂĄ vĂĄrios sĂ©culos, este continua a desafiar os produtores que tĂȘm que se debater com vĂĄrios problemas inerentes ao processo. O vinho base no qual as leveduras sĂŁo inoculadas bem como as condiçÔes que se desenvolvem ao longo da fermentação tornam o processo inĂłspito do ponto de vista biolĂłgico. Elevado teor de etanol inicial (8-11%) que tende a aumentar 2-3% durante a fermentação, baixas temperaturas (menores que 16ÂșC), baixo pH (3,3 ou menos), desenvolvimento de stress oxidativo e osmĂłtico, acumulação de CO2 e esgotamento de nutrientes sĂŁo algumas das principais adversidades que as leveduras tĂȘm de ultrapassar durante o processo. Dos stresses mencionados, as baixas temperaturas sĂŁo das que causam maiores problemas Ă fermentação. Por serem tĂŁo abaixo da temperatura Ăłptima de crescimento de S. cerevisiae (25ÂșC a 28ÂșC), o seu metabolismo celular Ă© de tal forma condicionado que algumas fermentaçÔes tornam-se vagarosas ou chegam mesmo a parar antes de terem sido completadas. Apesar de representarem um contratempo na fermentação, as baixas temperaturas sĂŁo um âmalâ necessĂĄrio. AlĂ©m de ser economicamente inviĂĄvel manter as extensas caves ou adegas a temperaturas elevadas, aumentar a temperatura faria com que as fermentaçÔes ocorressem a um ritmo demasiado rĂĄpido e muitas caracterĂsticas organolĂ©pticas tĂpicas destes vinhos nĂŁo teriam tempo para se desenvolver e seriam perdidas. AlĂ©m da temperatura, a disponibilidade de azoto tambĂ©m tem sido apontada como outro parĂąmetro que pode comprometer a fermentação pois este elemento torna-se muitas vezes um factor limitante no decorrer da fermentação e Ă© fundamental ao metabolismo celular. Dado que nĂŁo existem muitos estudos que se debrucem sobre a temĂĄtica do uso de leveduras encapsuladas em processos de segunda fermentação e sendo que questĂ”es como as que foram referidas anteriormente sĂŁo centrais na produção de vinhos efervescentes, pareceu-nos pertinente realizar um estudo aprofundado que abordasse vĂĄrias problemĂĄticas associadas a este processo fermentativo e com isso conseguir novas e importantes informaçÔes sobre o mesmo. Desta forma, o objectivo deste trabalho passou por realizar um estudo exaustivo das alteraçÔes e adaptaçÔes fisiolĂłgicas, citolĂłgicas e moleculares ocorridas na levedura S. cerevisiae durante um processo de segunda fermentação Ă escala real, a baixas temperaturas e com variação do teor de azoto assimilĂĄvel. Para tal, duas estirpes diferentes de S. cerevisiae encapsulada (aqui denominadas por SC1 e SC2 por razĂ”es de confidencialidade), produzidas e cedidas pela empresa Proenol, foram inoculadas no mesmo vinho base em garrafas de 750 ml. Previamente, o vinho base foi ajustado para duas concentraçÔes diferentes de azoto assimilĂĄvel (56 mg/ml e 100 mg/ml). As 4 condiçÔes (2 estirpes x 2 concentraçÔes de azoto assimilĂĄvel) foram ainda conjugadas com duas temperaturas diferentes (10ÂșC e 12ÂșC) gerando um total de 8 condiçÔes experimentais e que simulam possĂveis fermentaçÔes industriais. De forma a poder acompanhar a evolução da fermentação e da levedura, 4 tempo amostrais ao longo da fermentação foram estabelecidos em função da pressĂŁo atingida. Assim, as cĂ©lulas foram analisadas imediatamente antes da inoculação (pressĂŁo 0 bar â B0), no inĂcio (pressĂŁo 1 bar â B1), meio (pressĂŁo 3 bar â B3) e fim (pressĂŁo 5 bar â B5) da fermentação. Visto que a resposta e adaptação celular aos diferentes factores presentes nĂŁo Ă© dependente de apenas um processo biolĂłgico mas sim de vĂĄrios e da sua interligação, a melhor estratĂ©gia para conseguir obter conclusĂ”es vĂĄlidas e que conseguissem explicar essas alteraçÔes foi realizar uma anĂĄlise multiparamĂ©trica, integrativa e abrangente. Para tal, pela sua importĂąncia e potencial informação relevante, vĂĄrios parĂąmetros celulares foram escolhidos para integrar esta anĂĄlise do estado fisiolĂłgico, citolĂłgico e molecular das cĂ©lulas: cinĂ©tica de fermentação, viabilidade, vitalidade, trealose, glicogĂ©nio, lĂpidos neutros, glutationa, ĂĄcidos gordos, proteĂnas totais, ATP, expressĂŁo relativa de genes associados a diferentes stresses (HSP12, GSH1, TRX2 e GPD1) e propriedades sensoriais. A cinĂ©tica fermentativa foi determinada pela pressĂŁo de CO2 acumulada nas garrafas e pela concentração de glucose + frutose no vinho. A pressĂŁo foi obtida atravĂ©s de aferĂłmetros que foram colocados em garrafas piloto de cada condição e a concentração de glucose + frutose foi determinada pela empresa Proenol que colaborou no estudo. A viabilidade foi determinada por citometria de fluxo (FC) e azul de metileno (MB), apesar de no final apenas se ter usado os resultados relativos a FC devido Ă elevada correlação entre os dois mĂ©todos. Juntamente com a viabilidade, a vitalidade foi determinada por FC recorrendo a um kit comercial (baseado em dois corantes fluorescentes). O glicogĂ©nio, o principal carbohidrato de reserva, foi analisado por FC utilizando a acriflavina como corante fluorescente para a sua detecção. A trealose, um carbohidrato de reserva importante na resposta a vĂĄrios stresses, foi determinada por FC usando um reagente fluorescente comercial. Os lĂpidos neutros, importantes reservas lipĂdicas e energĂ©ticas, tambĂ©m foram analisados por FC usando um reagente fluorescente comercial. Todos os parĂąmetros analisados por FC foram submetidos a anĂĄlise de heterogeneidade da população. No caso da viabilidade e vitalidade esta anĂĄlise foi feita por observação directa da distribuição dos seus histogramas gerados na anĂĄlise por FC. No caso do glicogĂ©nio, trealose e lĂpidos neutros foi utilizado o coeficiente de variação robusto (RCV) das distribuiçÔes de fluorescĂȘncia. A glutationa, uma molĂ©cula envolvida em vĂĄrias funçÔes mas cuja principal Ă© a protecção oxidativa, foi determinada atravĂ©s do uso de uma sonda fluorogĂ©nica. A glutationa reduzida foi determinada e em seguida, para se poder determinar a glutationa oxidada, toda a glutationa foi reduzida atravĂ©s do uso da glutationa redutase, obtendo-se assim a glutationa total. A partir da glutationa total e reduzida, por dedução, foi determinada a glutationa oxidada. Os ĂĄcidos gordos, importantes constituintes da membrana plasmĂĄtica e envolvidos nas importantes alteraçÔes desta, foram determinados por GC-MS apĂłs extracção celular e a devida esterificação. As proteĂnas totais dosearam-se pelo mĂ©todo do biureto apĂłs extracção celular. O ATP foi determinado a partir de um kit comercial baseado na conversĂŁo da luciferina em oxiluciferina pela enzima luciferase, a qual gera um sinal fluoromĂ©trico passĂvel de ser medido. A expressĂŁo gĂ©nica relativa de HSP12, GPD1, GSH1 e TRX2 foi determinada com recurso Ă tĂ©cnica de qRT-PCR (PCR quantitativo em tempo real), utilizando o mĂ©todo ÎÎCT e aplicando a respectiva eficiĂȘncia de amplificação de cada gene. A normalização da expressĂŁo relativa foi feita com a mĂ©dia da expressĂŁo dos genes 18S e ACT1, ambos considerados genes de referĂȘncia. O cĂĄlculo da expressĂŁo relativa foi feito em relação ao B0 (respectivo de cada estirpe). HSP12 Ă© um gene de resposta geral ao stress, GSH1 e TRX2 sĂŁo genes envolvidos na resposta ao stress oxidativo e GPD1 na resposta ao stress osmĂłtico. A anĂĄlise estatĂstica dos resultados foi feita com recurso Ă anĂĄlise de variĂąncia (ANOVA) a 3 factores (ou 2 quando necessĂĄrio) e Ă anĂĄlise de componentes principais (PCA). No final do trabalho foi feita uma anĂĄlise sensorial ao vinho final obtido em cada uma das 8 condiçÔes experimentais. Para tal, um painel de 5 provadores profissionais de vinho foram convidados a realizar a prova e a avaliar cada um dos vinhos segundo vĂĄrias caracterĂsticas organolĂ©pticas importantes neste tipo de vinho. No fim da prova foi atribuĂda uma classificação global a cada um dos vinhos revelando qual ou quais as condiçÔes que resultaram num produto final de maior qualidade. A realização deste estudo permitiu obter informaçÔes importantes acerca do processo de segunda fermentação feito Ă escala industrial. A obtenção de um vinho efervescente, neste caso pelo mĂ©todo tradicional, Ă© de facto um processo bastante rigoroso e que impĂ”e um elevado nĂvel de stress Ă s leveduras. Os vĂĄrios parĂąmetros analisados revelaram uma forte adaptação por parte das leveduras e uma constante tentativa de contrabalançar as condiçÔes adversas presentes. O facto de a anĂĄlise levada a cabo ser uma anĂĄlise multiparamĂ©trica e integrativa permitiu nĂŁo sĂł recolher importantes informaçÔes sobre cada um dos parĂąmetros individualmente mas tambĂ©m analisar o processo sob uma perspectiva global e observar as relaçÔes estabelecidas entre eles e as variĂĄveis em estudo. Globalmente, a estirpe SC1 revelou ser a estirpe mais tolerante, robusta e resistente. NĂŁo sĂł esta estirpe mostrou melhores resultados em parĂąmetros fundamentais como viabilidade ou percentagem de cĂ©lulas metabolicamente activas, como tambĂ©m mostrou bons indicadores na acumulação de metabolitos celulares chave num processo de segunda fermentação. Maior teor de glicogĂ©nio, lĂpidos neutros ou ĂĄcidos gordos insaturados revelaram precisamente um maior poder de resiliĂȘncia e estabilidade fundamentais num ambiente tĂŁo inĂłspito. Por sua vez, a estirpe SC2 apesar de menos robusta, revelou ser mais plĂĄstica, activa e igualmente capaz de levar a cabo uma segunda fermentação. Uma das principais caracterĂsticas que esta estirpe revelou foi ter um maior poder fermentativo que a estirpe SC1 em quase todas as condiçÔes experimentais. Adicionalmente, a estirpe SC2 mostrou ainda indicadores de uma maior actividade celular e capacidade de resposta ao stress. Maior actividade esterĂĄsica, maior acumulação de trealose (um importante metabolito de resposta ao stress) e de ATP, e finalmente uma maior expressĂŁo gĂ©nica ao nĂvel de alguns genes ligados ao stress, revelam um forte poder adaptativo e de resposta Ă s vĂĄrias condiçÔes adversas. AlĂ©m das diferenças observadas entre estirpes tambĂ©m foi possĂvel confirmar a forte influĂȘncia das baixas temperaturas no processo fermentativo. Uma simples diminuição de 2ÂșC (de 12ÂșC para 10ÂșC) foi suficiente para tornar as fermentaçÔes lentas e com uma duração de cerca de 120 dias (o dobro esperado para uma segunda fermentação). Na base desta influĂȘncia negativa esteve uma diminuição na viabilidade, actividade metabĂłlica, acumulação de alguns metabolitos (glutationa e ĂĄcidos gordos) e expressĂŁo gĂ©nica que no final levaram a uma diminuição drĂĄstica da cinĂ©tica fermentativa. De uma forma geral, ambas as leveduras foram bem-sucedidas nas diferentes fermentaçÔes e deram provas de estarem aptas para levarem a cabo segundas fermentaçÔes em severas condiçÔes. Contudo, nas condiçÔes em que este ensaio foi realizado, 10ÂșC poderĂĄ ser uma temperatura demasiado baixa e que pode comprometer o sucesso do processo fermentativo. Relativamente Ă terceira variĂĄvel, a disponibilidade de azoto assimilĂĄvel, o seu impacto foi menos notĂłrio relativamente Ă s outras duas. No entanto, dada a importĂąncia deste nutriente no metabolismo celular, a aplicação de uma baixa concentração de azoto assimilĂĄvel levou a uma diminuição da cinĂ©tica fermentativa (mais evidente nas fermentaçÔes realizadas a 12ÂșC), Ă diminuição da actividade esterĂĄsica e menor acumulação de alguns metabolitos importantes tais como glicogĂ©nio, trealose e lĂpidos neutros, revelando assim a sua importĂąncia adicional aquando da realização de um processo de segunda fermentação. Ao longo da fermentação as populaçÔes de cĂ©lulas revelaram heterogeneidade nos teores de trealose e lĂpidos neutros, muito provavelmente por estes metabolitos estarem ligados Ă resposta ao stress e portanto estarem mais facilmente sujeitos a flutuaçÔes dentro da mesma população. Por sua vez, viabilidade, vitalidade e glicogĂ©nio revelaram maior homogeneidade, apenas com ligeiras variaçÔes, indicando uma maior consistĂȘncia no decorrer da fermentação. Na anĂĄlise em componentes principais (PCA) observou-se uma grande variação e dispersĂŁo das amostras, evidenciado pelo poder explicativo obtido com 3 componentes principais (apenas 58,9%). Na primeira componente principal (PC1) as amostras separam-se principalmente pela evolução de parĂąmetros de resposta ao stress (trealose, ATP e expressĂŁo relativa de HSP12, GSH1, TRX2 e GPD1. JĂĄ as componente principais PC2 e PC3 foram ambas explicadas pela variação dos parĂąmetros de viabilidade e vitalidade, estando tambĂ©m associadas Ă variação de glucose + frutose, lĂpidos neutros e proteĂnas totais (PC2) e Ă variação da saturação dos ĂĄcidos gordos (PC3). Foi possĂvel observar uma maior dispersĂŁo da estirpe SC2 no conjunto destes planos, bem como uma maior restrição e homogeneidade resultante de temperaturas mais baixas (10ÂșC) em ambas as estirpes. No final, apesar das diferenças encontradas entre as estirpes ao longo da fermentação, ambas tiveram uma boa performance fermentativa, equivalente e passĂvel de ser aplicada a uma escala industrial. Da mesma forma, ambas as estirpes revelaram a capacidade de produzir vinhos efervescentes com elevada qualidade e que embora com caracterĂsticas diferentes, obtiveram classificaçÔes organolĂ©pticas muito prĂłximas. Com isto conclui-se que seria errĂłneo afirmar que a estirpe SC1 ou SC2 Ă© melhor, sem antes conhecer as condiçÔes em que a segunda fermentação se vai realizar. Cada uma revelou vantagens e melhores resultados dependentes das condiçÔes em que fermentaram e portanto serĂĄ sem dĂșvida um factor a ter em conta no momento da escolha de uma estirpe de levedura. O factor temperatura, apesar de ter um impacto negativo a nĂvel celular e metabĂłlico, revelou ser importante nas caracterĂsticas organolĂ©pticas finais do vinho. Finalmente, a maior concentração de azoto assimilĂĄvel revelou ter um impacto global positivo no produto final embora durante a fermentação tenha sido a variĂĄvel que menos influĂȘncia teve sobre o comportamento e evolução das leveduras. | por |
| dc.identifier.uri | http://hdl.handle.net/10451/10170 | |
| dc.language.iso | eng | por |
| dc.subject | Saccharomyces cerevisiae | por |
| dc.subject | Fermentação | por |
| dc.subject | Vinho | por |
| dc.subject | Teses de mestrado - 2013 | por |
| dc.title | Sparkling wine yeasts performance: integrated characterization during second fermentation | por |
| dc.type | master thesis | |
| dspace.entity.type | Publication | |
| rcaap.rights | closedAccess | por |
| rcaap.type | masterThesis | por |