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Publicação
Effect of mitochondriotropic molecules in reducing oxidative stress in assisted reproduction techniques
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Orientador(es)
Resumo(s)
A infertilidade está a aumentar, sobretudo por problemas de origem genética ou patológica do
casal, mas também devido a fatores externos como nutricionais, estilo de vida e de impacto
ambiental. O fator ambiental é notório desde a revolução industrial e em alguns animais já se
estuda os transtornos que as alterações climáticas têm na fertilidade. Nos humanos, o estilo de
vida e o adiamento da gravidez, são os fatores externos que mais influenciam a infertilidade, com
redução da qualidade dos gametas e prejuízo do ambiente uterino e desenvolvimento embrionário.
A reprodução medicamente assistida (RMA) tem vindo a atenuar alguns dos problemas
associados à infertilidade desde 1978, data do nascimento do primeiro bebé de fertilização in vitro
(FIV). No entanto, apesar de grandes evoluções nas técnicas de RMA, a taxa de sucesso continua
baixa. Apenas 30% dos casais diagnosticados com algum tipo de infertilidade conseguem levar
uma gravidez até ao final.
Tanto em gravidezes naturais como em gravidezes auxiliadas por RMA, um fator que pode
influenciar a qualidade dos embriões é o nível de Reactive Oxygen Species (ROS). As ROS
ocorrem naturalmente no processo de respiração celular mitocondrial, resultantes da redução das
moléculas de oxigénio, e tem um papel importante na resposta celular. No entanto, dado à
toxicidade de ROS, os seus níveis são estritamente controlados por antioxidantes endógenos.
Quando a resposta endógena falha e os níveis de ROS ficam acima do limite, a célula entra em
stress oxidativo. Este stress pode ser devido a deficiências nutritivas, e em casos de recurso a
RMA, pode ser oriundo de exposição à luz, choques térmicos ou osmóticos, como também ao
desenvolvimento embrionário em ambientes ricos em oxigénio. O stress oxidativo pode levar à
morte celular, à pior qualidade embrionária e em última estância à perda do feto. Neste trabalho
é abordada a falta de terapias eficientes para a questão do stress oxidativo na reprodução assistida
e a intenção da obtenção de um tratamento para o mesmo.
O problema do stress oxidativo é algo recorrentemente estudado, sendo usadas diferentes terapias
que incluem a suplementação dos meios de cultura com antioxidantes. Estes antioxidantes, tal
como os antioxidantes endógenos, têm o papel de eliminar o ROS ou de manter a célula num
estado redox, para manter níveis de ROS saudáveis. Muitos antioxidantes utilizados como terapia
já foram testados e mais recentemente a adição de antioxidantes com a mitocôndria como alvo
obtiveram bons resultados, devido à síntese de ROS ser realizada principalmente na mitocôndria.
Neste estudo, pretendemos testar a inclusão de novos antioxidantes dirigidos para as mitocôndrias
no meio de cultura dos embriões, de forma a aumentar a qualidade de embriões viáveis
produzidos. Estudámos dois antioxidantes inovadores, o AntiOxBEN2 e o AntiOxCIN4, e
investigámos os seus efeitos, qual a melhor concentração dos diferentes fármacos e a comparação
entre os dois em embriões posteriormente submetidos ao processo de criopreservação. Para este
estudo foi utilizado o bovino como modelo animal, onde os oócitos foram aspirados dos ovários
proveniente do matadouro e maturados em laboratório, seguindo-se a fertilização in vitro e a
cultura dos pressupostos zigotos em meio de cultura suplementado com os antioxidantes
produzidos pela nossa equipa. O estudo foi dividido em 3 experiências principais, sendo que as
duas primeiras se debruçaram na testagem das melhores concentrações dos dois antioxidantes e,
a terceira experiência, sobre a comparação dos dois antioxidantes nas suas melhores
concentrações em embriões posteriormente criopreservados. Os 3172 pressupostos zigotos foram
divididos nas 2 experiência iniciais sendo que a primeira experiência, testou 3 doses de
AntiOxCIN4 (1µM CIN; 2.5 µM CIN; 10 µM CIN) e a segunda experiência testou 3 doses de
AntiOxBEN2 (1µM BEN; 2.5 µM BEN;10 µM BEN), sempre comparadas com um grupo controlo, sem antioxidante. Nos dias 2, 7 e 9, os embriões de cada experiência foram analisados
morfologicamente (taxas de desenvolvimento e qualidade). As células totais e viáveis foram
examinadas, como também os estados da mitocôndria, através do potencial de membrana e por
fim, foram avaliados os níveis de ROS. Todas as analises, excetuando as morfológicas, foram
realizadas com corantes fluorescentes específicos. Nestas primeiras experiências, os melhores
resultados foram obtidos com as concentrações de 2.5µM CIN e 2.5µM BEN. A dose de 2.5 µM
CIN destacou-se pela diminuição de embriões de má qualidade (P= 0.031) e a de 2.5 µM BEN
por um maior número de embriões de boa qualidade (P=0.0014) e um acréscimo no número total
de células dos embriões (P=0.01). Assim, estas duas concentrações foram selecionadas para a
terceira experiência
Na terceira experiência, os pressupostos zigotos forma divididos em três grupos: controlo; 2.5µM
CIN; 2.5µM BEN. Posteriormente os embriões com qualidade (grau 1 e 2) foram vitrificados e
descongelados. Foram igualmente analisados quanto à morfologia antes e depois da congelação,
incluindo as taxas de criosobrevivência (integridade e expansão) e de células totais e viáveis,
estado da mitocôndria e níveis de ROS, como nas experiências anteriores. Nesta última
experiência, os dois antioxidantes obtiveram bons resultados nos ensaios de qualidade, no entanto
AntiOxBEN2 obteve os melhores resultados nas expansões dos embriões após descongelação e
cultura (64.7% dos embriões expandiram com a concentração de 2.5BEN enquanto o grupo
controlo só obteve 36.4% de embriões expandidos, P=0.05). O Grupo 2.5 CIN também apresentou
melhores taxas de expansão quando comparado com o controlo (P=0.09). Resultados anteriores
da nossa equipa demonstraram que o AntiOxCIN4 tinha uma maior capacidade antioxidante, mas
que o AntiOxBEN2 era mais dirigido à mitocôndria, revelando-se um antioxidante mais estável.
O AntiOxBEN2 demonstrou ser uma melhor terapia para o stress oxidativo em embriões,
aumentando a sua qualidade e a capacidade de resistir ao processo de criopreservação.
Este estudo teve algumas limitações no número de embriões produzidos. Tendo em conta a
quantidade de ensaios que foram realizados, com elevado número de doses a testar devido ao
carater inovador da aplicação dos antioxidantes desenvolvidos, seria necessário um N maior para
podermos ter algumas conclusões mais robustas nas análises do estado da mitocôndria e nos
valores de ROS. Esses dados seriam essenciais para aferirmos sobre como os antioxidantes afetam
a mitocôndria e se de fato há uma redução de ROS durante a cultura dos embriões. Para superar
essa limitação, analises complementares teriam de ser feitas para haver uma confirmação dos
nossos dados. Seria ainda benéfico fazer um estudo sobre como AntiOxCIN4 e AntiOxBEN2
influenciam a expressão genica de alguns componentes essenciais para a recuperação das células
após o stress oxidativo. Apesar de já existirem vários estudos a defender que estes antioxidantes
tem uma influência positiva no pool de antioxidantes endógenos, esta informação terá de ser
confirmada em embriões.
Apesar de ser necessário alguns estudos para a corroboração de dados, AntiOxCIN4 e
AntiOxBEN2 já revelaram ter resultados promissores e até mesmo demonstraram ter capacidades
para competir com antioxidantes que já se encontram no mercado como por exemplo o MitoQ10.
O MitoQ10 apesar de ter uma grande capacidade de antioxidante releva-se toxico para as células
até mesmo em baixas concentrações, enquanto o AntiOxCIN4 e o AntiOxBEN2 em
concentrações baixas demonstram excelente capacidade antioxidativa e sem toxicidade. A
suplementação destes dois antioxidantes, principalmente do AntiOxBEN2, no meio de
desenvolvimento dos embriões tem implicações benéficas para o desenvolvimento embrionário,
sendo uma promissora terapia para o stress oxidativo e uma ótima solução para as técnicas de
RMA.
Over the past decades, an expansion of assisted reproductive techniques (ART) has been reported. Even so, the process continues to have a low success rate, being necessary to optimize these procedures. One of the setbacks of ART is the oxidative stress, impairing the embryo development, namely by delaying this development or even inducing cell death or apoptosis. In this work, the lack of effective therapies for oxidative stress in ART is approached as well as the aim of getting a reduction of the oxidative stress during embryo production. We hypothesised that the inclusion of new antioxidants directed to mitochondria in the embryo culture medium improves the quality of viable embryos. We have studied two different antioxidants, AntiOxBEN2 and AntiOxCIN4 that were synthesised by our team. This work was performed with cattle gametes in three experiments. Abattoir derived oocytes were matured and submitted to in vitro fertilization, and the presumptive zygotes were divided into culture medium supplemented with antioxidants. In the first and second experiments, we have investigated the effects of the antioxidants on embryo development and tested their best concentrations. The first experiment focused on the effects of AntiOxCIN4 at the concentration of 1 μM, 2.5 μM, and 10 μM and the second on the effects of the AntiOxBEN2 at the concentration of 1 μM, 2.5 μM, and 10 μM. A control group without supplementation run simultaneously. The third experiment had the aim to compare the two antioxidants molecules in their best concentrations as well as the performance of cryopreserved embryos. In each experiment, embryos were morphologically evaluated, the total and viable cells were examined, as well as ROS levels and the mitochondrial state, through the membrane potential evaluation, using specific fluorescent dyes. With this novel therapy, in experiments 1 and 2, we achieved an increase of embryo quality on the concentrations of 2.5 μM AntiOxCIN4 (P= 0.031) and 2.5 μM AntiOxBEN2 P=0.0014). In the experiment 3, an improvement in the cryosurvival in both antioxidants, being the AntiOxBEN2 standing out with the best results (expansion rates after vitrification/warming and culture, P=0.05). This study had some limitations due to the low number of embryos, which caused some doubts in the mechanism that caused the embryo quality increased, and more studies will be needed to understand this process. However, it was found the concentration that achieved goods results in the embryo's development and in cryosurvival which points to a possible good therapy for oxidative stress.
Over the past decades, an expansion of assisted reproductive techniques (ART) has been reported. Even so, the process continues to have a low success rate, being necessary to optimize these procedures. One of the setbacks of ART is the oxidative stress, impairing the embryo development, namely by delaying this development or even inducing cell death or apoptosis. In this work, the lack of effective therapies for oxidative stress in ART is approached as well as the aim of getting a reduction of the oxidative stress during embryo production. We hypothesised that the inclusion of new antioxidants directed to mitochondria in the embryo culture medium improves the quality of viable embryos. We have studied two different antioxidants, AntiOxBEN2 and AntiOxCIN4 that were synthesised by our team. This work was performed with cattle gametes in three experiments. Abattoir derived oocytes were matured and submitted to in vitro fertilization, and the presumptive zygotes were divided into culture medium supplemented with antioxidants. In the first and second experiments, we have investigated the effects of the antioxidants on embryo development and tested their best concentrations. The first experiment focused on the effects of AntiOxCIN4 at the concentration of 1 μM, 2.5 μM, and 10 μM and the second on the effects of the AntiOxBEN2 at the concentration of 1 μM, 2.5 μM, and 10 μM. A control group without supplementation run simultaneously. The third experiment had the aim to compare the two antioxidants molecules in their best concentrations as well as the performance of cryopreserved embryos. In each experiment, embryos were morphologically evaluated, the total and viable cells were examined, as well as ROS levels and the mitochondrial state, through the membrane potential evaluation, using specific fluorescent dyes. With this novel therapy, in experiments 1 and 2, we achieved an increase of embryo quality on the concentrations of 2.5 μM AntiOxCIN4 (P= 0.031) and 2.5 μM AntiOxBEN2 P=0.0014). In the experiment 3, an improvement in the cryosurvival in both antioxidants, being the AntiOxBEN2 standing out with the best results (expansion rates after vitrification/warming and culture, P=0.05). This study had some limitations due to the low number of embryos, which caused some doubts in the mechanism that caused the embryo quality increased, and more studies will be needed to understand this process. However, it was found the concentration that achieved goods results in the embryo's development and in cryosurvival which points to a possible good therapy for oxidative stress.
Descrição
Tese de mestrado, Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento, 2022, Faculdade de Ciências, Universidade de Lisboa
Palavras-chave
Desenvolvimento embrionário Stress oxidativo Reprodução assistida ROS Antioxidantes dirigidos para a mitocôndria Teses de mestrado - 2022