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Publicação
Amyloid β peptide and p63 : two prime triggers of neural apoptosis and differentiation
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Orientador(es)
Resumo(s)
Amyloid β (Aβ) peptide accumulation and apoptosis play an important role in the pathogenesis of Alzheimer’s disease. However, the mechanisms by which Aβ mediates neuronal apoptosis are not completely elucidated. Mounting evidence also supports the involvement of specific apoptosis factors in neural stem cell (NSC) differentiation. Therefore, we set to identify and characterize new molecular pathways involved in Aβ-induced regulation of neural apoptosis and differentiation. First, we further explored the molecular mechanisms of Aβ-induced neuronal death. We found that Aβ elicited stabilization of the pro-apoptotic isoform of p63, TAp63, which in turn was partially inhibited by tauroursodeoxycholic acid. In addition, in response to Aβ-induced apoptosis, the abundance of the anti-apoptotic isoform of p63, ΔNp63, was clearly reduced and tightly regulated in a c-Jun-dependent mechanism. Next, we investigated whether apoptosis-associated molecule p63, member of the p53 family, might also be involved in differentiation of NSCs. We showed that TAp63γ interacted with the histone H3 lysine 27-specific demethylase JMJD3, a key regulator of neurogenesis, to redirect NSCs to differentiation, as an alternative to cell death. In addition, both TAp63γ and JMJD3 were coordinately regulated to establish a neural-specific gene expression pattern during NSC differentiation. We also found that JMJD3-demethylase activity was crucial in regulating TAp63γ half-life and nuclear accumulation. Finally, we evaluated the ability of Aβ peptides to modulate NSC proliferation and differentiation, and investigated whether autophagy was involved in Aβ-induced alterations of NSC fate. We showed that Aβ1-40 and Aβ1-42 strongly enhanced neurogenesis and gliogenesis, respectively, while Aβ25-35 did not influence NSC fate. Notably, autophagy was implicated in Aβ-mediated effects in NSCs, independently of reactive oxygen species production and apoptosis induction. In conclusion, the work presented here provides additional insights into the molecular mechanisms implicated in Aβ- and p63-induced cell death signaling pathways, and extends our knowledge in considering these prime triggers of apoptosis as integral components of neural proliferation and differentiation.
A doença de Alzheimer (AD) é uma doença neurodegenerativa caracterizada pela ocorrência de perturbações na função sináptica e perda massiva de neurónios nas regiões cerebrais relacionadas com as funções cognitivas, como o hipocampo e o córtex cerebral. A deposição do péptido β amilóide (Aβ) na AD foi desde cedo reportada como sendo um aspeto crucial nos fenómenos patológicos da doença, nomeadamente na formação de placas senis. Vários estudos mostram que o stress oxidativo, a inflamação, a perturbação dos fluxos de cálcio e a morte celular programada estão envolvidos na toxicidade induzida pelo Aβ. Contudo, os mecanismos pelos quais o péptido Aβ desencadeia a morte neuronal não são, ainda, completamente conhecidos. Um melhor conhecimento desses mecanismos básicos, desencadeados pelo péptido Aβ, poderá constituir um importante contributo para retardar, ou até prevenir, a neurodegenerescência associada à AD. Por outro lado, alguns dos fatores associados ao processo apoptótico podem também modular a proliferação e a diferenciação. Os mecanismos regulatórios desta tomada de decisão, quanto ao destino das células, dependem do balanço e da conjugação de sinais de sobrevivência e de morte celular. De facto, o nosso grupo demonstrou já que caspases, calpaínas, p53 e microRNAs associados à apoptose aceleram o processo de diferenciação neural. Além disso, foi recentemente sugerido que o péptido Aβ pode também regular a proliferação e diferenciação de células estaminais neurais (NSCs). Estas células são capazes de originar os principais tipos de células neurais, incluindo neurónios e células da glia, como os astrócitos e os oligodendrócitos. Em cada divisão celular, as NSCs podem seguir destinos celulares diferentes, nomeadamente continuar o processo proliferativo, ou iniciar a diferenciação. Assim, propusémo-nos identificar e caracterizar novos fatores e vias moleculares envolvidas na regulação da apoptose e da diferenciação neural, que sejam relevantes no contexto da AD. Explorámos, inicialmente, mecanismos moleculares subjacentes à apoptose induzida pelo Aβ em células neuronais PC12 e em neurónios corticais de cultura primária. A incubação com o péptido Aβ resultou na estabilização da isoforma pro- -apoptótica da proteína p63, pertencente à família p53, TAp63, bem como na degradação da isoforma anti-apoptótica, ΔNp63, através de um mecanismo dependente do proteossoma e de cinases de proteínas ativadas pelo mitogénio. Este efeito encontrou-se associado a um aumento dos níveis proteicos de c-Jun, um fator de transcrição envolvido na regulação do destino das células, já anteriormente reportado como sendo modulador da abundância de TAp63. Curiosamente, a pré-incubação das células com um agente anti-apoptótico, o ácido tauro-ursodesoxicólico (TUDCA), reverteu o efeito do Aβ nas proteínas TAp63 e c-Jun. De igual forma, em células tratadas com compostos genotóxicos, como a cisplatina e a doxorrubina, verificámos um aumento da expressão de c-Jun, associado a uma redução dos níveis proteícos da isoforma ΔNp63. A expressão endógena e ectópica de ΔNp63 foi também dramaticamente reduzida aquando da sobrexpressão de c-Jun. Recorrendo à tecnologia de silencimento com siRNAs, silenciámos c-Jun em células tratadas com Aβ, o que preveniu a degradação da isoforma ΔNp63. Por outro lado, a sobreexpressão de c-Jun originou a redução dos níveis de ΔNp63. Por fim, verificámos que o tempo de semi-vida de ΔNp63 foi significantemente reduzido na presença de c-Jun, confirmando assim o papel de c-Jun na regulação da estabilidade de ΔNp63. Estes resultados indicaram que a abundância de ΔNp63, em resposta à morte apoptótica induzida pelo Aβ, é regulada por um mecanismo dependente de c-Jun. De seguida, investigámos o envolvimento da proteína p63 na regulação do potencial de proliferação e diferenciação de NSCs. De facto, a proteína p53, homóloga de p63, foi recentemente descrita como fator limitante do potencial proliferativo das células estaminais, desempenhando mesmo um papel crucial durante a neurogénese. Por outro lado, foi também demonstrado que os efeitos pró-neurogénicos da proteína p53 resultam da sua interação com reguladores importantes da diferenciação neural, como a desmetilase JMJD3, específica para o resíduo de lisina-27 da histona 3. Considerando as semelhanças funcionais e estruturais entre as proteínas p53 e p63, investigámos uma possível interação molecular entre a desmetilase JMJD3 e a proteína p63 durante o processo de neurogénese. A proteína p63 já foi descrita como estando envolvida na diferenciação da epiderme e de outros tecidos epiteliais. Contudo, o seu envolvimento durante a diferenciação neural não foi inteiramente esclarecido. Os resultados obtidos demonstraram que a isoforma TAp63γ interage diretamente com a desmetilase JMJD3 e que esta regula os níveis de p63, estabelecendo-se um programa de expressão de marcadores neurais. De facto, a sobrexpressão de JMJD3 promoveu um aumento dos níveis de TAp63γ, de forma dependente da sua atividade de desmetilase. A sobrexpressão de TAp63γ aumentou os níveis do marcador de neurónios β-III tubulina, enquanto que o silenciamento de TAp63γ resultou em efeitos significativamente diferentes. Ensaios de imunoprecipitação permitiram-nos confirmar a interação direta entre TAp63γ e JMJD3, durante a diferenciação de NSCs, assim como a modulação dos níveis de metilação de TAp63γ pela JMJD3. Curiosamente, a JMJD3 regulou também a estabilidade e a distribuição celular da isoforma TAp63γ, bem como o processo de neurogénese regulado pela TAp63γ. Estes resultados clarificam o papel da proteína p63 na diferenciação das células precursoras neurais e demonstram que a isoforma TAp63γ é um alvo direto da JMJD3, sendo esta interação importante para a neurogénese. Por fim, avaliámos a capacidade de diferentes péptidos Aβ modularem os processos de proliferação e diferenciação de NSCs, clarificando o papel da autofagia nos efeitos mediados pelos péptidos Aβ. De facto, embora considerados neurotóxicos, os péptidos Aβ estão também envolvidos em diversos eventos celulares não patogénicos. Por outro lado, a autofagia tem sido implicada na sobrevivência celular em resposta à toxicidade do Aβ, mas também em processos de diferenciação. Contudo, o seu papel concreto na diferenciação neural continua por esclarecer. Os resultados obtidos demonstraram que os péptidos Aβ1-40 e Aβ1-42 promovem preferencialmente a neurogénese e a gliogénese, respetivamente, enquanto que o péptido Aβ25-35 não parece ter qualquer efeito nestes processos. Verificámos também que o papel do Aβ1-40 na neurogénese é parcialmente dependente da sua função na proliferação de NSCs. Tal foi comprovado pelo aumento da fase S do ciclo celular e pelo aumento da marcação com bromodeoxiuridina em células expostas a Aβ1-40. Além disso, o péptido Aβ1-40 aumentou a atividade do promotor de Tuj1, validando assim os resultados anteriores que mostram o papel importante do péptido Aβ1-40 na diferenciação neuronal. Observámos também que o processo autofágico parece estar envolvido nos efeitos mediados pelos diferentes péptidos Aβ nas NSCs, independentemente da produção de espécies reativas de oxigénio e da ocorrência de fenómenos apoptóticos. Inibindo a autogafia, através da adição do inibidor autofágico 3-metiladenina, verificou-se que os níveis proteicos de marcadores neuronais e gliais não aumentaram, mesmo na presença dos diferentes péptidos Aβ. Assim, estes resultados suportam e clarificam o papel de diferentes péptidos Aβ na regulação do destino celular das NSCs e sublinham a importância da autofagia no controlo deste processo. Em conclusão, estes estudos contribuem com dados novos relativamente ao papel do péptido Aβ e da proteína p63 no controlo da decisão entre diferenciação e morte celular, os quais se poderão revelar úteis na modulação do destino celular na AD.
A doença de Alzheimer (AD) é uma doença neurodegenerativa caracterizada pela ocorrência de perturbações na função sináptica e perda massiva de neurónios nas regiões cerebrais relacionadas com as funções cognitivas, como o hipocampo e o córtex cerebral. A deposição do péptido β amilóide (Aβ) na AD foi desde cedo reportada como sendo um aspeto crucial nos fenómenos patológicos da doença, nomeadamente na formação de placas senis. Vários estudos mostram que o stress oxidativo, a inflamação, a perturbação dos fluxos de cálcio e a morte celular programada estão envolvidos na toxicidade induzida pelo Aβ. Contudo, os mecanismos pelos quais o péptido Aβ desencadeia a morte neuronal não são, ainda, completamente conhecidos. Um melhor conhecimento desses mecanismos básicos, desencadeados pelo péptido Aβ, poderá constituir um importante contributo para retardar, ou até prevenir, a neurodegenerescência associada à AD. Por outro lado, alguns dos fatores associados ao processo apoptótico podem também modular a proliferação e a diferenciação. Os mecanismos regulatórios desta tomada de decisão, quanto ao destino das células, dependem do balanço e da conjugação de sinais de sobrevivência e de morte celular. De facto, o nosso grupo demonstrou já que caspases, calpaínas, p53 e microRNAs associados à apoptose aceleram o processo de diferenciação neural. Além disso, foi recentemente sugerido que o péptido Aβ pode também regular a proliferação e diferenciação de células estaminais neurais (NSCs). Estas células são capazes de originar os principais tipos de células neurais, incluindo neurónios e células da glia, como os astrócitos e os oligodendrócitos. Em cada divisão celular, as NSCs podem seguir destinos celulares diferentes, nomeadamente continuar o processo proliferativo, ou iniciar a diferenciação. Assim, propusémo-nos identificar e caracterizar novos fatores e vias moleculares envolvidas na regulação da apoptose e da diferenciação neural, que sejam relevantes no contexto da AD. Explorámos, inicialmente, mecanismos moleculares subjacentes à apoptose induzida pelo Aβ em células neuronais PC12 e em neurónios corticais de cultura primária. A incubação com o péptido Aβ resultou na estabilização da isoforma pro- -apoptótica da proteína p63, pertencente à família p53, TAp63, bem como na degradação da isoforma anti-apoptótica, ΔNp63, através de um mecanismo dependente do proteossoma e de cinases de proteínas ativadas pelo mitogénio. Este efeito encontrou-se associado a um aumento dos níveis proteicos de c-Jun, um fator de transcrição envolvido na regulação do destino das células, já anteriormente reportado como sendo modulador da abundância de TAp63. Curiosamente, a pré-incubação das células com um agente anti-apoptótico, o ácido tauro-ursodesoxicólico (TUDCA), reverteu o efeito do Aβ nas proteínas TAp63 e c-Jun. De igual forma, em células tratadas com compostos genotóxicos, como a cisplatina e a doxorrubina, verificámos um aumento da expressão de c-Jun, associado a uma redução dos níveis proteícos da isoforma ΔNp63. A expressão endógena e ectópica de ΔNp63 foi também dramaticamente reduzida aquando da sobrexpressão de c-Jun. Recorrendo à tecnologia de silencimento com siRNAs, silenciámos c-Jun em células tratadas com Aβ, o que preveniu a degradação da isoforma ΔNp63. Por outro lado, a sobreexpressão de c-Jun originou a redução dos níveis de ΔNp63. Por fim, verificámos que o tempo de semi-vida de ΔNp63 foi significantemente reduzido na presença de c-Jun, confirmando assim o papel de c-Jun na regulação da estabilidade de ΔNp63. Estes resultados indicaram que a abundância de ΔNp63, em resposta à morte apoptótica induzida pelo Aβ, é regulada por um mecanismo dependente de c-Jun. De seguida, investigámos o envolvimento da proteína p63 na regulação do potencial de proliferação e diferenciação de NSCs. De facto, a proteína p53, homóloga de p63, foi recentemente descrita como fator limitante do potencial proliferativo das células estaminais, desempenhando mesmo um papel crucial durante a neurogénese. Por outro lado, foi também demonstrado que os efeitos pró-neurogénicos da proteína p53 resultam da sua interação com reguladores importantes da diferenciação neural, como a desmetilase JMJD3, específica para o resíduo de lisina-27 da histona 3. Considerando as semelhanças funcionais e estruturais entre as proteínas p53 e p63, investigámos uma possível interação molecular entre a desmetilase JMJD3 e a proteína p63 durante o processo de neurogénese. A proteína p63 já foi descrita como estando envolvida na diferenciação da epiderme e de outros tecidos epiteliais. Contudo, o seu envolvimento durante a diferenciação neural não foi inteiramente esclarecido. Os resultados obtidos demonstraram que a isoforma TAp63γ interage diretamente com a desmetilase JMJD3 e que esta regula os níveis de p63, estabelecendo-se um programa de expressão de marcadores neurais. De facto, a sobrexpressão de JMJD3 promoveu um aumento dos níveis de TAp63γ, de forma dependente da sua atividade de desmetilase. A sobrexpressão de TAp63γ aumentou os níveis do marcador de neurónios β-III tubulina, enquanto que o silenciamento de TAp63γ resultou em efeitos significativamente diferentes. Ensaios de imunoprecipitação permitiram-nos confirmar a interação direta entre TAp63γ e JMJD3, durante a diferenciação de NSCs, assim como a modulação dos níveis de metilação de TAp63γ pela JMJD3. Curiosamente, a JMJD3 regulou também a estabilidade e a distribuição celular da isoforma TAp63γ, bem como o processo de neurogénese regulado pela TAp63γ. Estes resultados clarificam o papel da proteína p63 na diferenciação das células precursoras neurais e demonstram que a isoforma TAp63γ é um alvo direto da JMJD3, sendo esta interação importante para a neurogénese. Por fim, avaliámos a capacidade de diferentes péptidos Aβ modularem os processos de proliferação e diferenciação de NSCs, clarificando o papel da autofagia nos efeitos mediados pelos péptidos Aβ. De facto, embora considerados neurotóxicos, os péptidos Aβ estão também envolvidos em diversos eventos celulares não patogénicos. Por outro lado, a autofagia tem sido implicada na sobrevivência celular em resposta à toxicidade do Aβ, mas também em processos de diferenciação. Contudo, o seu papel concreto na diferenciação neural continua por esclarecer. Os resultados obtidos demonstraram que os péptidos Aβ1-40 e Aβ1-42 promovem preferencialmente a neurogénese e a gliogénese, respetivamente, enquanto que o péptido Aβ25-35 não parece ter qualquer efeito nestes processos. Verificámos também que o papel do Aβ1-40 na neurogénese é parcialmente dependente da sua função na proliferação de NSCs. Tal foi comprovado pelo aumento da fase S do ciclo celular e pelo aumento da marcação com bromodeoxiuridina em células expostas a Aβ1-40. Além disso, o péptido Aβ1-40 aumentou a atividade do promotor de Tuj1, validando assim os resultados anteriores que mostram o papel importante do péptido Aβ1-40 na diferenciação neuronal. Observámos também que o processo autofágico parece estar envolvido nos efeitos mediados pelos diferentes péptidos Aβ nas NSCs, independentemente da produção de espécies reativas de oxigénio e da ocorrência de fenómenos apoptóticos. Inibindo a autogafia, através da adição do inibidor autofágico 3-metiladenina, verificou-se que os níveis proteicos de marcadores neuronais e gliais não aumentaram, mesmo na presença dos diferentes péptidos Aβ. Assim, estes resultados suportam e clarificam o papel de diferentes péptidos Aβ na regulação do destino celular das NSCs e sublinham a importância da autofagia no controlo deste processo. Em conclusão, estes estudos contribuem com dados novos relativamente ao papel do péptido Aβ e da proteína p63 no controlo da decisão entre diferenciação e morte celular, os quais se poderão revelar úteis na modulação do destino celular na AD.
Descrição
Tese de doutoramento, Ciências Biomédicas (Neurociências), Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2013
Palavras-chave
Péptidos beta-amiloides Apoptose Autofagia Células-tronco neurais Neurogénese Teses de doutoramento - 2013