Publicação
Biophysical and functional studies to unravel the biomedical potential of plant defensin PvD1
| datacite.subject.fos | Ciências Médicas::Ciências da Saúde | pt_PT |
| dc.contributor.advisor | Castanho, Miguel Rico Botas | |
| dc.contributor.author | Skalska, Julia | |
| dc.date.accessioned | 2024-03-19T14:02:38Z | |
| dc.date.available | 2024-06-01T00:30:24Z | |
| dc.date.issued | 2021-05 | |
| dc.date.submitted | 2020-02 | |
| dc.description.abstract | Due to the unique mode of action and high selectivity, plant defensins (PDs) constitute a group of therapeutic candidates worthy of note. PDs are involved in the first-line defense system in plants having strong antimicrobial action on a wide variety of pathogens. Numerous studies highlighted the activity of several PDs against human infectious pathogens including resistant species of bacteria and viruses, and even cancer. This remarkable set of biological activities is additionally enriched by the low toxicity of healthy mammalian cells. This set of notable facets makes plant defensins interesting pharmaceutical candidates for further development. However, entry to the clinical pipeline requires a thorough characterization of the mode of action of a drug lead. Despite a reasonable understanding of the mode of action of plant defensins on microorganisms, there are very few reports elaborating on mechanisms in which PDs exert a harmful effect on cancer cells. To this end, the major pitfall concerns the production of PDs in quantities enabling detailed investigation on relevant in vitro and in vivo models. Chemical synthesis is the most frequently used method in the pharmaceutical manufactory. Nevertheless, several concerns discourage using this technique to produce more “complicated” peptides, such as plant defensins. PDs have a long sequence containing multiple cysteine residues. These residues are involved in intramolecular covalent disulfide bonds thus regulate peptide’s 3D structure. Consequently, due to the highly knotted folding, PDs have been mostly obtained through isolation from the plant extract or by heterologous expression systems. Natural peptide PvD1 is a representative of plant defensins family originating from common bean (Phaseolus vulgaris) from Brazil. This peptide shares common structural facets with other members of PDs such as the canonical CSαβ motif. PvD1 shows strong antifungal activity, yet it has been also shown to have antiprotozoal and anticancer properties, concurrently presenting a low toxicity profile on healthy human cells. Such a remarkable multifunctional action of this peptide calls for deepening the understanding of PvD1’s mode of action to further explore its medical application. Vibrant communication between cancer cells regulates their growth, development, and progression. This communication can be mediated by various signalling pathways enabling the contact between cells and extracellular matrix (ECM). One such pathway is tumour-derived exosomes (TDE). These are nano-sized vesicles that originated from the endosomal membrane and secreted by cells. As TDE can transmit genetic material and proteins they play a regulatory function in intracellular crosstalk. Moreover, they have been found to alleviate cancer survival mechanisms, such as multi-drug resistance. Hence, the development of the anticancer agent that could target TDE would envision an interesting strategy for tumour eradication. This first part of the project aimed to target the production of exosomes by breast cancer cells with natural PvD1 peptide. Here we focused on the modulatory effect of PvD1 on the expression level of CD63 and CD9 tetraspanin proteins in TDE. These proteins play an important role in controlling the formation of exosomes and are enriched in exosomal membranes. Additionally, the interaction of PvD1 with various biological membranes was followed by the combination of tailored biophysical techniques including dynamic light scattering (DLS), atomic force microscopy (AFM), and surface plasmon resonance (SPR). The innovative approach of immobilizing exosomes on the surface of the SPR sensor chip revealed that PvD1 can bind to these vesicles. Furthermore, a semi-quantitative analysis of the peptide-membrane interaction in TDE confirmed that, after binding PvD1, remains inserted and resides in the exosomal membrane. In contrast to exosomes, PvD1 does not cause perturbations of the membrane of cancer cells, presumably translocating inside the cell and targeting intracellular functions. Within this work, we contributed to broadening the understanding of the anticancer action of PvD1 and envision an innovative strategy for treating cancer. The advent of solid-phase chemical synthesis (SPPS) has enabled the easy production of pharmaceutical peptides. In addition, SPPS provides the tools for endless sequence manipulation to improve peptides’ properties or facilitate research. These comprise terminal modifications such as methylation or lipidation, introduction/deletion of amino acids, or labelling with fluorophores. Therefore, the goal of the second part of this work was to reproduce synthetically natural peptide PvD1. Analytical and structural analyses were employed in order to compare natural peptide with a synthetically obtained replica. Besides, solution-phase nuclear magnetic resonance (NMR) allowed elucidation of PvD1's structure, yet, predicted only by homology with defensin VrD2. Overlapping spectra of these two peptides and equal RP-HPLC elution time, provide strong evidence suggesting an identical structure. Moreover, to verify biological activity assays were performed on a collection of Candida species. It has been shown by in vitro and in vivo tests that both natural and synthetic PvD1 have expected antifungal activity, determined by the presence of glucosylceramide (GlcCer) in fungal membranes. Additionally, thanks to multiple disulfide bridges, tightly stabilizing the 3D structure, PvD1 preserves high resistance to proteolytic degradation. Overall, this work elaborates on the multifunctional activity of PvD1 peptide revealing a novel mechanism of anticancer action of plant defensin as well as strong antifungal properties. Adding susceptibility of this peptide to the chemical synthesis production method poses a valuable strategy for medical application either as a therapy alone or as a co-adjuvant in conventional treatments. | pt_PT |
| dc.description.abstract | Devido ao seu único modo de ação e à sua alta seletividade, as defensinas de plantas (DPs) constituem um grupo de candidatos terapêuticos digno de ter em conta. As DPs estão envolvidas na primeira linha de defesa em plantas, tendo uma forte ação antimicrobiana em uma ampla variedade de patogénios. Numerosos estudos destacaram a atividade de várias DPs contra patogénios infeciosos humanos, incluindo espécies resistentes de bactérias e vírus e até cancro. Este notável conjunto de atividades biológicas é enriquecido adicionalmente pela baixa toxicidade para células de mamíferos saudáveis. Este conjunto de facetas notáveis faz com que as DPs se tornem candidatos farmacêuticos interessantes a serem mais desenvolvidos no futuro. No entanto, a entrada no pipeline clínico requer uma caracterização completa do modo de ação da molécula. Apesar de uma compreensão razoável do modo de ação das DPs nos microrganismos, existem poucos estudos que investiguem os mecanismos pelos quais as DPs exercem um efeito prejudicial sobre as células cancerígenas. Para esse fim, a principal limitação está relacionada com a produção de DPs em quantidades que permitirão uma investigação detalhada usando modelos in vitro e in vivo. A síntese química é o método mais frequentemente usado no setor farmacêutico. No entanto, várias preocupações desencorajam o uso desta técnica para produzir péptidos mais "complicados", como as DPs. As DPs têm uma longa sequência contendo vários resíduos de cisteína. Esses resíduos estão envolvidos em ligações covalentes intramoleculares, as ligações de dissulfeto, que regulam a estrutura 3D do péptido. Consequentemente, devido ao seu folding, as DPs foram principalmente obtidas através do isolamento do extrato da planta ou por sistemas de expressão heterólogos. O péptido natural PvD1 é um representante da família das DPs originárias do feijão comum brasileiro (Phaseolus vulgaris). Este péptido partilha facetas estruturais comuns com outros membros de DPs, como o motivo típico CSαβ. O PvD1 mostra uma forte atividade antifúngica, mas também tem propriedades antiprotozoárias e anticancerígenas, apresentando simultaneamente um baixo perfil de toxicidade em células humanas saudáveis. Uma ação multifuncional tão notável deste péptido exige uma compreensão mais profunda do modo de ação do PvD1 para explorar ainda mais a sua aplicação médica. A comunicação vibrante entre as células cancerígenas regula o seu crescimento, desenvolvimento e progressão. Essa comunicação pode ser mediada por várias vias de sinalização, permitindo o contato entre as células e a matriz extracelular. Uma dessas vias é mediada pelos exossomas derivados de tumores. Estes são vesículas de tamanho nanométrico que têm origem na membrana dos endossomas e são secretadas pelas células. Como os exossomas derivados de tumores podem transmitir material genético e proteínas, estes desempenham uma função reguladora no crosstalk intracelular. Além disso, os exossomas derivados de tumores aliviam os mecanismos de sobrevivência do cancro, como a resistência a múltiplos fármacos. Portanto, o desenvolvimento de um agente anticancerígeno que conseguiria ter como alvo os exossomas derivados de tumores poderá ser uma estratégia interessante para a erradicação do tumor. O objetivo desta primeira parte do projeto era originar a produção de exossomas por células de cancro de mama com péptidos PvD1 naturais. Aqui, focámo-nos no efeito modulador do PvD1 no nível de expressão das proteínas tetraspanina CD63 e CD9 nos exossomas derivados de tumores. Estas proteínas desempenham um papel importante no controlo da formação de exossomas e são abundantes nas membranas exossómicas. Além disso, a interação de PvD1 com várias membranas biológicas foi seguida pela combinação de técnicas biofísicas, incluindo a dispersão de luz dinâmica, a microscopia de força atómica e a ressonância de plasma de superfície. A abordagem inovadora de imobilizar exossomas na superfície do chip sensor da ressonância de plasma de superfície revelou que o PvD1 se pode ligar a essas vesículas. Além disso, uma análise semi-quantitativa da interação péptido-membrana nos exossomas derivados de tumores confirmou que, após a ligação, o PvD1 permanece inserido na membrana exossómica. Ao contrário dos exossomas, o PvD1 não causa perturbações na membrana das células cancerígenas, presumivelmente translocando-se para dentro da célula e modulando funções intracelulares. Neste trabalho, contribuímos para aumentar o conhecimento da ação anticancerígena do PvD1 e conceber uma estratégia inovadora para o tratamento do cancro. A introdução da síntese química em fase sólida permitiu a fácil produção de péptidos com ação farmacêutica. Além disso, a síntese química em fase sólida fornece as ferramentas para a manipulação de sequências ilimitadas, com o objetivo de melhorar as propriedades dos péptidos ou facilitar a investigação. Estes contêm modificações nos terminais, tais como metilação ou prenilação, introdução / eliminação de aminoácidos ou marcação com fluoróforos. Portanto, o objetivo da segunda parte deste trabalho era reproduzir sinteticamente o péptido natural PvD1. Análises analíticas e estruturais foram utilizadas para comparar o péptido natural com uma réplica obtida sinteticamente. Além disso, a ressonância magnética nuclear em solução permitiu a elucidação da estrutura de PvD1, ainda que prevista apenas por homologia com a defensina VrD2. Os espectros sobrepostos destes dois péptidos e o tempo de eluição de RP-HPLC igual fornecem uma forte evidência para a conjetura de uma estrutura idêntica. Além disso, para verificar a atividade biológica, foram realizados ensaios numa coleção de espécimes de Candida. Foi demonstrado por testes in vitro e in vivo que quer o PvD1 natural quer o sintético possuem a atividade antifúngica esperada, determinada pela presença de glucosilceramida nas membranas fúngicas. Além disso, devido às várias ligações dissulfeto, que estabilizam firmemente a estrutura 3D, o PvD1 preserva uma elevada resistência à degradação proteolítica. No geral, este trabalho dedicou-se ao estudo da atividade multifuncional do péptido PvD1, revelando um novo mecanismo de ação anticancerígeno da DP, além de fortes propriedades antifúngicas. A suscetibilidade deste péptido para o método de produção de síntese química representa uma estratégia valiosa para a aplicação médica como terapia isolada ou como co- adjuvante em tratamentos convencionais. | pt_PT |
| dc.identifier.tid | 101547145 | pt_PT |
| dc.identifier.uri | http://hdl.handle.net/10451/63525 | |
| dc.language.iso | eng | pt_PT |
| dc.relation | Biophysical studies tounravel the mechanism of action of anticancer peptides | |
| dc.subject | Defensina de planta | pt_PT |
| dc.subject | Exossoma | pt_PT |
| dc.subject | Anticancerígenos | pt_PT |
| dc.subject | Síntese química em fase sólida | pt_PT |
| dc.subject | Antifúngicos | pt_PT |
| dc.subject | Teses de doutoramento - 2021 | pt_PT |
| dc.title | Biophysical and functional studies to unravel the biomedical potential of plant defensin PvD1 | pt_PT |
| dc.type | doctoral thesis | |
| dspace.entity.type | Publication | |
| oaire.awardTitle | Biophysical studies tounravel the mechanism of action of anticancer peptides | |
| oaire.awardURI | info:eu-repo/grantAgreement/FCT//PD%2FBD%2F114177%2F2016/PT | |
| person.familyName | Skalska | |
| person.givenName | Julia | |
| person.identifier.orcid | 0000-0001-8129-4095 | |
| project.funder.identifier | http://doi.org/10.13039/501100001871 | |
| project.funder.name | Fundação para a Ciência e a Tecnologia | |
| rcaap.rights | openAccess | pt_PT |
| rcaap.type | doctoralThesis | pt_PT |
| relation.isAuthorOfPublication | 74285bf2-cf1a-414c-9a1e-92b14345e5a8 | |
| relation.isAuthorOfPublication.latestForDiscovery | 74285bf2-cf1a-414c-9a1e-92b14345e5a8 | |
| relation.isProjectOfPublication | 92276962-d077-47b6-99a6-dc0c4e6244e7 | |
| relation.isProjectOfPublication.latestForDiscovery | 92276962-d077-47b6-99a6-dc0c4e6244e7 | |
| thesis.degree.name | Tese de doutoramento, Ciências Biomédicas (Biofísica e Bioquímica Médica), Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2021 | pt_PT |