A carregar...
Publicação
Regulation of CFTR membrane stability - crosstalk between signalling pathways and the cytoskeleton
| Nome: | Descrição: | Tamanho: | Formato: | |
|---|---|---|---|---|
| 1.65 MB | Adobe PDF |
Orientador(es)
Resumo(s)
A Fibrose Quística (FQ) é a doença autossómica recessiva letal mais comum na população caucasiana, afetando 1 em cada 2500-6000 recém-nascidos. A doença é causada por mutações no gene Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) que codifica a proteína CFTR. Até à data já foram descritas mais de 2000 variantes neste gene, a maioria das quais causadora de FQ. A mutação mais comum é a deleção do resíduo de fenilalanina na posição 508 (F508del) e causa um defeito no tráfego e função devido à conformação incorreta da proteína. Clinicamente a FQ é caracterizada por insuficiência respiratória e doença pulmonar crónica que é a principal causa de mortalidade e morbilidade. A desregulação de CFTR leva a uma redução do volume de líquido superficial das vias respiratórias e consequentemente a um muco espesso e desidratado que impede a limpeza mucociliar e leva à acumulação de bactérias e agentes patogénicos que conduzem à doença pulmonar crónica. A glicoproteína CFTR pertence à superfamília dos transportadores ABC (do inglês ATP-binding cassette) e funciona como um canal de cloreto e bicarbonato regulado por cAMP, sendo expressa na membrana apical de várias células epiteliais, onde regula o movimento de água essencial para a manutenção da homeostase celular. Estruturalmente, a proteína é constituída por cinco domínios: dois domínios transmembranares, que constituem o poro do canal; dois domínios de ligação ao ATP e um domínio regulador, responsável pela abertura e fecho do canal. Durante a síntese proteica, a proteína CFTR é inserida co-traducionalmente na membrana do retículo endoplasmático, onde adquire a sua conformação nativa e passa por um processo de glicosilação inicial dando origem a uma forma imatura (designada banda B). Depois a proteína é transportada ao complexo de Golgi onde sofre processamento originando a forma madura (banda C). A forma madura de CFTR é então transportada por vesículas até à membrana plasmática onde exerce a sua função. Os níveis de proteína na membrana plasmática são ainda controlados por dois processos, endocitose e reciclagem. Na membrana plasmática a ancoragem da proteína ao citoesqueleto de actina contribui para a sua estabilidade membranar. Esta ancoragem está dependente da interação com diversas proteínas e consequente formação de complexos proteicos. A identificação do complexo CFTR-EPAC1 que depende da proteína NHERF1, veio destacar um duplo papel de regulação do canal por cAMP – baixas concentrações de cAMP ativam a proteína PKA para regular a função de CFTR, enquanto concentrações mais elevadas de cAMP promovem o aumento dos níveis da proteína na membrana plasmática num processo dependente da ativação de EPAC1. Recentemente esta comunicação entre as vias de sinalização de cAMP e o citoesqueleto de actina foi mais detalhadamente caracterizada pela identificação de duas novas proteínas que interagem com CFTR, INF2 e CAPZA2, que são proteínas reguladoras da dinâmica do citoesqueleto de actina. A proteína INF2 é um membro da família das forminas que se associa às terminações farpadas dos filamentos de actina e pode acelerar o processo de nucleação do filamento, mover de forma processiva com o filamento em elongação, impedir o bloqueio das terminações farpadas e ainda acelerar a despolimerização do filamento de actina, sendo que esta atividade é única quando comparada com os outros membros da família das forminas. A proteína CAPZA2 é um componente da proteína heterodimérica CapZ que também se associa às terminações farpadas e impede a substituição de monómeros de actina na terminação do filamento, levando à paragem da elongação. Estes dois reguladores do citoesqueleto de actina interagem com a proteína CFTR nos complexos proteicos macromoleculares que se formam na membrana plasmática após ativação de EPAC1. Foi identificado que INF2 atua como regulador negativo e CAPZA2 como regulador positivo dos níveis de CFTR na membrana plasmática, uma vez que a subexpressão (knockdown - KD) de INF2 provoca um aumento de CFTR na membrana e por contraste o KD de CAPZA2 conduz a uma diminuição. Dados anteriores sugerem que o efeito negativo da proteína INF2 na ancoragem de CFTR à membrana plasmática se deva a processos de despolimerização nos filamentos farpados ou corte junto desses filamentos. Por outro lado, a proteína CAPZA2 promove a ancoragem de CFTR na membrana plasmática através de um efeito estabilizador do citoesqueleto de actina nos filamentos farpados. Os mecanismos pelos quais INF2 e CAPZA2 atuam em conjunto para promover um efeito na regulação da dinâmica do citoesqueleto de actina e na estabilidade de CFTR wt na membrana plasmática não estão totalmente caracterizados e compreendidos e para além disso não há informações quanto ao efeito na proteína CFTR mutante. Deste modo, este trabalho teve como objetivo principal caracterizar o papel do citoesqueleto de actina na regulação de CFTR na membrana plasmática após ativação de EPAC1, com foco no impacto da modulação de INF2 e CAPZA2 na proteína CFTR wt e F508del, dividindo-se em três tarefas: 1) Estudar os mecanismos pelos quais os reguladores de citoesqueleto de actina influenciam a expressão e localização de CFTR wt. 2) Determinar o impacto da modulação dos reguladores de citoesqueleto na atividade de CFTR wt. 3) Determinar o impacto da modulação dos reguladores de citoesqueleto na expressão, localização e estabilidade de CFTR F508del resgatada. Os resultados da primeira tarefa confirmam o efeito oposto do KD de INF2 e CAPZA2 na expressão de CFTR wt na membrana plasmática já conhecido, observando-se que o KD de INF2 aumenta os níveis de CFTR na forma madura e que o KD de CAPZA2 leva à diminuição. Para o KD combinado de ambos os reguladores de citoesqueleto observa-se um efeito similar ao KD de CAPZA2, ou seja, uma diminuição nos níveis de CFTR wt na membrana plasmática - no entanto esta diminuição é menos acentuada do que a observada para o KD de CAPZA2 individualmente. Este resultado sugere que o efeito do KD de CAPZA2 domina sobre o efeito do KD de INF2, o que sugere que CAPZA2 também domine sobre INF2 na regulação da ancoragem de CFTR à membrana plasmática. Para além disso, este resultado aponta para um modelo de competição CAPZA2/INF2 ao regular a ancoragem de CFTR à membrana plasmática, modelo este em que a proteína CAPZA2 domina na associação às terminações barbadas dos filamentos de actina e por isso o seu efeito positivo sobrepõem-se ao efeito negativo de INF2. Para a segunda tarefa, optou-se por estudar o impacto da modulação dos reguladores de citoesqueleto na atividade de CFTR em organóides intestinais, pois este é um modelo mais relevante do ponto de vista fisiológico uma vez que é derivado de materiais de indivíduos com FQ. Os resultados mostraram que a ativação de EPAC1 em organóides intestinais não altera a função de CFTR. Após um teste que confirmou a correta atividade do composto utilizado para ativar EPAC1 (007-AM), identificou-se que não há expressão detetável da proteína EPAC1 em organoides intestinais, independentemente da mutação de CFTR que estes possam ter. Este resultado justifica a ausência de efeito na função de CFTR após ativação de EPAC1. Alternativas para estudar o impacto da modulação de reguladores do citoesqueleto na atividade de CFTR, podem ser a utilização de ensaios baseados no quenching de YFP (do inglês Yellow fluorescent protein) ou ensaios em câmara de Ussing efetuados em linhas celulares. Os resultados da terceira tarefa mostram que o KD de INF2 aumenta o resgate de CFTR F508del promovido pelo corretor VX-661. Este efeito, apesar de não depender da ativação de EPAC1, é aumentado nessas condições, o que contrasta com o efeito conhecido para o KD de INF2 em CFTR wt que está dependente da ativação de EPAC1. Os resultados mostram ainda que o KD de INF2 tem um forte efeito de estabilização da forma imatura de CFTR F508del, sugerindo que INF2 possa ter um papel na fase inicial de tráfego de CFTR, ainda não caracterizado. Para além disto, identificou-se que o KD de INF2 promove uma diminuição do turnover de CFTR F508del resgatada, com um aumento de semi vida de 15.7 min no controlo negativo para 68.8 min. Estes resultados sugerem que a diminuição na degradação de proteína seja o mecanismo subjacente ao efeito estabilizador do KD de INF2 no resgate de CFTR F508del observado, podendo envolver uma diminuição na endocitose ou um aumento na reciclagem. Assim, estes resultados fornecem evidência para que INF2 seja considerado como um potencial alvo terapêutico para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas combinadas de modo a melhorar a estabilidade de CFTR F508del resgatada na membrana plasmática. Globalmente, este trabalho constitui uma importante caracterização do efeito dos reguladores do citoesqueleto de actina sobre a proteína CFTR após ativação de EPAC1, ligando a comunicação entre vias de sinalização de cAMP e o citoesqueleto de actina à modulação de CFTR e possivelmente ao tratamento de FQ.
Cystic fibrosis is the most common lethal autosomic recessive disease among the Caucasian population. It is caused by mutations in the gene encoding the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) protein, a cAMP-regulated chloride and bicarbonate channel expressed at the apical surface of epithelial cells. The most common CF-causing mutation is a deletion of phenylalanine 508 (F508del) that leads to CFTR misfolding and consequent degradation. Regulation of CFTR at the plasma membrane (PM) is a complex process involving different interaction partners, signalling pathways and the actin cytoskeleton. Among these, there is a two-level regulation of the channel by cAMP – low concentrations of cAMP activate PKA to regulate CFTR function whereas higher cAMP levels promote EPAC1-dependent increase of its PM levels. This last cAMP signalling pathway has a crosstalk with the actin cytoskeleton through two novel CFTR interactors, the actin cytoskeleton regulators INF2 and CAPZA2. INF2 is a negative regulator and CAPZA2 a positive regulator of wt-CFTR levels at the PM under EPAC1 activation. However, the mechanisms behind this INF2/CAPZA2 regulation of actin cytoskeleton dynamics and thus wt-CFTR PM stability are not completely characterized and there is no information about the effect in F508del-CFTR. The main goal of the present work was to characterize the role of the actin cytoskeleton in the regulation of CFTR at the PM under EPAC1 activation by cAMP, with a focus on the impact of INF2 and CAPZA2 modulation on wt- and rescued F508del-CFTR at the PM. First, cell surface biotinylation results confirmed the known opposite regulation of INF2 and CAPZA2 on wt-CFTR levels at the PM and showed that combined knockdown (KD) of both actin cytoskeleton regulators leads to a decrease in wt-CFTR PM levels, similar to the effect of CAPZA2 KD alone. This suggests that CAPZA2 KD has a dominant effect over INF2 KD and that a competitive model where CAPZA2 dominates binding to the actin filament barbed ends should explain the INF2/CAPZA2 regulation of CFTR anchoring at the PM. Next, forskolin-induced swelling (FIS) assays showed that EPAC1 activation with 007-AM has no effect in CFTR function in the intestinal organoid model. After confirming the correct activity of the batch of 007-AM under use through a live cell imaging assay, the FIS assays results were explained by the identification that there is no detectable expression of EPAC1 in intestinal organoids, independently of CFTR mutation, leading to the conclusion that this model is not suitable for the study of the EPAC1 stabilization pathway. Finally, results show that INF2 KD improves rescue of F508del-CFTR by VX-661 independently of EPAC1 activation, although the effect is improved by it. INF2 KD also promotes a strong stabilizing effect on immature CFTR, suggesting that INF2 may also have a role in early CFTR traffic not yet characterized. It was also identified that INF2 KD leads to a decrease in rescued F508del-CFTR turnover, with an increase in protein half-life from 15.7 min in the negative control to 68.8 min. This suggests that the stabilizing effect of INF2 KD on rescued F508del-CFTR at the PM is caused by a decrease in degradation, possibly through a decrease in endocytosis or an increase in recycling. This is evidence for INF2 to be considered as a novel potential target for modulation to develop new combinatorial therapies for CF. Altogether, the work presented here constitutes an important characterization of how actin cytoskeleton regulators impact CFTR under EPAC1 activation, exploring the crosstalk between cAMP signalling pathways and the cytoskeleton to CFTR modulation, and possibly CF handling.
Cystic fibrosis is the most common lethal autosomic recessive disease among the Caucasian population. It is caused by mutations in the gene encoding the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) protein, a cAMP-regulated chloride and bicarbonate channel expressed at the apical surface of epithelial cells. The most common CF-causing mutation is a deletion of phenylalanine 508 (F508del) that leads to CFTR misfolding and consequent degradation. Regulation of CFTR at the plasma membrane (PM) is a complex process involving different interaction partners, signalling pathways and the actin cytoskeleton. Among these, there is a two-level regulation of the channel by cAMP – low concentrations of cAMP activate PKA to regulate CFTR function whereas higher cAMP levels promote EPAC1-dependent increase of its PM levels. This last cAMP signalling pathway has a crosstalk with the actin cytoskeleton through two novel CFTR interactors, the actin cytoskeleton regulators INF2 and CAPZA2. INF2 is a negative regulator and CAPZA2 a positive regulator of wt-CFTR levels at the PM under EPAC1 activation. However, the mechanisms behind this INF2/CAPZA2 regulation of actin cytoskeleton dynamics and thus wt-CFTR PM stability are not completely characterized and there is no information about the effect in F508del-CFTR. The main goal of the present work was to characterize the role of the actin cytoskeleton in the regulation of CFTR at the PM under EPAC1 activation by cAMP, with a focus on the impact of INF2 and CAPZA2 modulation on wt- and rescued F508del-CFTR at the PM. First, cell surface biotinylation results confirmed the known opposite regulation of INF2 and CAPZA2 on wt-CFTR levels at the PM and showed that combined knockdown (KD) of both actin cytoskeleton regulators leads to a decrease in wt-CFTR PM levels, similar to the effect of CAPZA2 KD alone. This suggests that CAPZA2 KD has a dominant effect over INF2 KD and that a competitive model where CAPZA2 dominates binding to the actin filament barbed ends should explain the INF2/CAPZA2 regulation of CFTR anchoring at the PM. Next, forskolin-induced swelling (FIS) assays showed that EPAC1 activation with 007-AM has no effect in CFTR function in the intestinal organoid model. After confirming the correct activity of the batch of 007-AM under use through a live cell imaging assay, the FIS assays results were explained by the identification that there is no detectable expression of EPAC1 in intestinal organoids, independently of CFTR mutation, leading to the conclusion that this model is not suitable for the study of the EPAC1 stabilization pathway. Finally, results show that INF2 KD improves rescue of F508del-CFTR by VX-661 independently of EPAC1 activation, although the effect is improved by it. INF2 KD also promotes a strong stabilizing effect on immature CFTR, suggesting that INF2 may also have a role in early CFTR traffic not yet characterized. It was also identified that INF2 KD leads to a decrease in rescued F508del-CFTR turnover, with an increase in protein half-life from 15.7 min in the negative control to 68.8 min. This suggests that the stabilizing effect of INF2 KD on rescued F508del-CFTR at the PM is caused by a decrease in degradation, possibly through a decrease in endocytosis or an increase in recycling. This is evidence for INF2 to be considered as a novel potential target for modulation to develop new combinatorial therapies for CF. Altogether, the work presented here constitutes an important characterization of how actin cytoskeleton regulators impact CFTR under EPAC1 activation, exploring the crosstalk between cAMP signalling pathways and the cytoskeleton to CFTR modulation, and possibly CF handling.
Descrição
Tese de mestrado em Bioquímica (Bioquímica Médica), Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2020
Palavras-chave
CFTR Fibrose Quística Sinalização de cAMP Citoesqueleto de actina Teses de mestrado - 2020