A carregar...
Publicação
Characterization of bacteria isolated from Portuguese traditional cheeses
| Nome: | Descrição: | Tamanho: | Formato: | |
|---|---|---|---|---|
| 2.03 MB | Adobe PDF |
Autores
Resumo(s)
A fermentação tradicional de queijos e realizada em muitos países do mundo, nomeadamente
Portugal, sendo que consiste no aproveitamento dos microrganismos naturalmente presentes no leite cru. Estes microrganismos encontram-se no leite devido as diferentes etapas de colheita e manuseamento durante e apos esse processo. Sendo que, alteram as moléculas presentes no leite através da fermentação dando novas propriedades ao produto final que será posteriormente curado. As condições destas fases de fermentação e maturação diferem entre tipos de queijos e zonas de produção, determinando as propriedades organoleticas do produto final. Os queijos de Azeitão e Nisa fazem parte dos 10 queijos portugueses que possuem a categoria de denominação de origem protegida (DOP). As zonas de produção dos queijos de Azeitão são Palmela, Sesimbra e Setúbal e as de Nisa são Nisa, Crato, Castelo de Vide, Marvão, Portalegre, Monforte, Arronches e Alter do Chão. Ambos são produzidos com leite de ovelha cru. No caso de Nisa o leite provém de uma raça de ovelha chamada Merina Branca e no caso de Azeitão não se especifica uma raça. O coalho vegetal usado na produção de ambos queijos é obtido de Cynara cardunculus L. Devido às diferentes fases e condições de produção o queijo de Azeitão consiste numa pasta semi-mole e amanteigada, de cor branca ou ligeiramente amarelada com um sabor ácido e salgado. O queijo de Nisa consiste numa pasta semi-dura de cor branca amarelada com um sabor ligeiramente ácido e um cheiro intenso. As bactérias ácido lácticas (BAL) são um grupo de vários géneros que partilham características em
comum como serem gram-positivas, catálase negativas, não formam esporos, anaeróbicas facultativas e terem um nível G+C baixo. Para além disto, o seu nome provém da sua capacidade para fermentar açúcares, transformando-os em ácido láctico através de homo- ou heterofermentacao. Este grupo e o predominante em leite cru e, portanto, em queijos produzidos de forma artesanal e essas bactérias vão desempenhar diversos papéis ao longo da fermentação e maturação deste tipo de queijo. Os géneros de BAL que predominam em comidas fermentadas como os queijos são Lactococcus, Streptococcus, Pediococcus, Leuconostoc, Lactobacillus e Enterococcus. Tendo em conta que estas bactérias formam parte tanto da cadeia alimentar como da microbiota de animais e seres humanos podem servir como
veículo de transmissão de genes ao existir uma transferência genética entre espécies ou géneros, como descrito na literatura. A problemática desta possível transferência ocorre quando esses genes conferem resistência a antibióticos ou fatores de virulência que anteriormente essas bactérias não possuíam. Essa transferência pode ocorrer para algumas bactérias que formam parte da nossa microbiota e são responsáveis por infecções oportunistas ou para bactérias patogénicas presentes no nosso corpo devido a uma infecção. Resistências adquiridas a antibióticos tem sido estudadas e observadas em BAL, em concreto em Enterococcus spp. devido ao seu papel patogénico oportunista. Foram descritas resistências a antibióticos de diferentes classes como ϐ-lactâmicos, cefalosporinas, aminoglicosidos, lincosamidas e estreptograminas. Em concreto, resistências a tetraciclina e eritromicina são das mais preocupantes devido a importância destes antibióticos e porque esta resistência tem sido atribuída ao uso indevido de antibióticos em comida de animais. Este trabalho teve como objetivo continuar o estudo de queijos de Azeitão e Nisa DOP que começou numa dissertação anterior onde se caracterizaram estes queijos pela sua microbiota e propriedades físico-químicas. Seguido deste estudo foi também analisada a diversidade dos microbiomas destes produtos como parte de outra dissertação. Assim, o presente trabalho consistiu em comparar os resultados anteriores de diversidade e caracterização microbiológica assim como completar essa análise com a procura de resistências a antibióticos e fatores de virulência. Durante o ano de 2018 foram recolhidos queijos de seis queijarias de Azeitão e de duas queijarias de Nisa. A partir destes foram feitas contagens de unidades formadoras de colonias (UFC) e isoladas as bactérias de diferentes grupos, nomeadamente, BAL isoladas com meio MRS (maioritariamente Lactobacillus spp.), Lactococcus spp. com meio M17 e Enterococcus spp. isoladas com meio SBA. Depois foi extraído o ADN desses isolados para realizar a técnica de RAPD-PCR e análise de dendrogramas criados com os perfis de bandas obtidos. A partir estes dendrogramas foi analisada a semelhança entre os isolados dos distintos queijos e foram obtidos índices de diversidades dos diferentes grupos de bactérias e queijarias estudadas. Esta diversidade e as contagens de bactérias foram comparadas as obtidas noutras dissertações deste mesmo projeto nas quais se estudaram anos de produção anteriores. Partindo destes mesmos dendrogramas, foram escolhidos isolados representantes de cada queijaria e realizados testes de resistência a antibióticos assim como a presença de factores de virulência. Relativo aos diferentes anos de produção estudados não foi observada uma tendência clara de contagens de UFC quando comparados os anos ou queijarias, isto e, não houve queijos que tivessem consistentemente maior ou menor numero de bactérias sendo que este numero foi variável ao longo dos anos. Enquanto a diversidade, foram observadas poucas coincidências nas queijarias com maior ou menor índice de diversidade. No caso dos lactococos foi observado o menor índice correspondente aos anos 2018 e 2016 na mesma queijaria, A4. Nos enterococos foi também encontrada a menor diversidade na mesma queijaria, N9, nos queijos dos anos 2018 e 2016. Nas amostras de 2018 o grupo com maior diversidade foi o dos enterococos mas cabe destacar que os três grupos bacterianos tiveram índices muito parecidos. A identificação dos representantes deste grupo de bactérias dos queijos de 2017 foi realizada com uma multiplex PCR e a maioria de isolados foi identificado como E. faecium, seguido por E. faecalis y E. durans estando igualmente representados em número de isolados. Foram encontradas diferenças significativas no numero de resistências ao longo dos anos nos grupos Lactococcus spp e Enterococcus spp. No caso deste último género, ocorreram também diferenças significativas entre o número de isolados resistentes de diferentes queijarias durante os três anos estudados. As resistências a antibióticos encontradas no grupo de BAL foram a clindamicina e eritromicina, no caso dos lactococos as resistências que foram observadas neste trabalho são consideradas intrínsecas pelo que não haveria possibilidade de transferência dessas resistências para outras bactérias. As resistências extrínsecas encontradas nos enterococos foram a teicoplanina, ciprofloxacina, tetraciclina, cloranfenicol, eritromicina e vancomicina. Apesar de terem sido observados isolados resistentes a três antibióticos de três classes diferentes estes não cumpriam todos os requisitos de modo a serem considerados multirresistentes. No estudo de fatores de virulência foi detetada a capacidade de hemólise em 11% dos representantes de 2016, 6% nos de 2017 e 12% nos de 2018. No teste para identificar a produção de gelatinase so foram observados dois resultados positivos e esses pertenciam a isolados de queijos de 2017. Concluindo, a diversidade do microbioma e as contagens dos queijos de Azeitão e Nisa estudados não seguiram nenhum padrão nos anos que foram comparados. O número de Enterococcus spp. resistentes diminuiu desde 2016 ate ao ultimo ano estudado neste trabalho, 2018, mas as resistências encontradas nos isolados de 2018 foram a antibióticos mais relevantes para a saúde pública como são a vancomicina, eritromicina e tetraciclina. No mesmo sentido, também não foram encontrados isolados multirresistentes e os fenótipos dos fatores de virulência estudados não foram observados em grande quantidade. Contudo, deve ser referido que o estudo destes queijos continuara e serão feitos mais testes tanto no âmbito da diversidade como do potencial patogénico dos isolados das bactérias acido lácticas presentes.
Azeitão and Nisa cheeses are products with protected designation of origin (PDO) traditionally manufactured in Portugal with sheep’s raw milk. The predominant group of bacteria in cheeses is lactic acid bacteria (LAB) which includes genera like Lactococcus spp. and Enterococcus spp., these are the microorganisms our work will be focusing on. The fact that these bacteria have important roles both in foods and the gut of animals (including humans) makes them conductors for both positive impact, such as probiotic features, and negative impact, such as transference of virulence factors or antibiotic resistances. Our aim with this work was to analyse the diversity of LAB in Azeitão and Nisa cheeses from several origins and years of production and assess the negative traits these bacteria could have and transfer such as antibiotic resistances, hemolysis and production of gelatinase. Enumeration of previously mentioned bacteria was performed, and results were compared to other years of production. During the years studied no unit had consistently higher CFU counts. Lactococcus spp. was the group with highest bacteria counts in the majority of units during the three years studied and Enterococcus spp. was the one with the lowest CFU. For diversity analysis, RAPD-PCR were performed in order to create dendrograms for each cheesemaking unit and bacterial group. Just like for bacterial enumeration, no specific trends were observed in the diversity values for the units throughout the studied years. Concerning 2018 cheeses, the group with the highest diversity was Enterococcus spp. even though it was also the one with less CFU. This independence between CFU counts and diversity was noted all through our work in different years, units and groups of bacteria. Identification of 2017 enterococci representatives was performed using a multiplex PCR and showed a predominance of E. faecium, followed by E. faecalis and E. durans that were equally represented. Pathogenic potential of representative isolates was assessed through the search of antibiotic resistances and virulence factors. Antibiotic susceptibility was studied through disc diffusion assays. Significant differences were observed in the number of resistances found in studied years for lactococci and enterococci. Between units there was also significant differences in the total number of resistances during 2016, 2017 and 2018 in enterococci. In LAB isolates resistances considered non intrinsic were found, to clindamycin and erythromycin. Furthermore, enterococci isolates resistant to teicoplanin, ciprofloxacin, tetracycline, chloramphenicol, erythromycin and vancomycin were observed. Isolates resistant to three or more antimicrobial agents were observed but these didn’t comply with the characteristics necessary to be classified as multidrug-resistant (MDR) bacteria. Virulence factors were studied and hemolysis was detected in 11% of representative isolates from 2016, 6% from 2017 and 12% in isolates from 2018 cheeses. Furthermore, only two positive results for gelatinase were found in 2017 representative isolates. In conclusion, our results showed that no pattern of bacterial enumeration or microbiome diversity is present throughout different years of production in artisanal cheeses such as the ones studied. Moreover, although alarming resistances were found in enterococci no multi-drug resistance isolates were observed. Further work should be performed to continue the characterization of the pathogenic potential of isolates present in these cheeses.
Azeitão and Nisa cheeses are products with protected designation of origin (PDO) traditionally manufactured in Portugal with sheep’s raw milk. The predominant group of bacteria in cheeses is lactic acid bacteria (LAB) which includes genera like Lactococcus spp. and Enterococcus spp., these are the microorganisms our work will be focusing on. The fact that these bacteria have important roles both in foods and the gut of animals (including humans) makes them conductors for both positive impact, such as probiotic features, and negative impact, such as transference of virulence factors or antibiotic resistances. Our aim with this work was to analyse the diversity of LAB in Azeitão and Nisa cheeses from several origins and years of production and assess the negative traits these bacteria could have and transfer such as antibiotic resistances, hemolysis and production of gelatinase. Enumeration of previously mentioned bacteria was performed, and results were compared to other years of production. During the years studied no unit had consistently higher CFU counts. Lactococcus spp. was the group with highest bacteria counts in the majority of units during the three years studied and Enterococcus spp. was the one with the lowest CFU. For diversity analysis, RAPD-PCR were performed in order to create dendrograms for each cheesemaking unit and bacterial group. Just like for bacterial enumeration, no specific trends were observed in the diversity values for the units throughout the studied years. Concerning 2018 cheeses, the group with the highest diversity was Enterococcus spp. even though it was also the one with less CFU. This independence between CFU counts and diversity was noted all through our work in different years, units and groups of bacteria. Identification of 2017 enterococci representatives was performed using a multiplex PCR and showed a predominance of E. faecium, followed by E. faecalis and E. durans that were equally represented. Pathogenic potential of representative isolates was assessed through the search of antibiotic resistances and virulence factors. Antibiotic susceptibility was studied through disc diffusion assays. Significant differences were observed in the number of resistances found in studied years for lactococci and enterococci. Between units there was also significant differences in the total number of resistances during 2016, 2017 and 2018 in enterococci. In LAB isolates resistances considered non intrinsic were found, to clindamycin and erythromycin. Furthermore, enterococci isolates resistant to teicoplanin, ciprofloxacin, tetracycline, chloramphenicol, erythromycin and vancomycin were observed. Isolates resistant to three or more antimicrobial agents were observed but these didn’t comply with the characteristics necessary to be classified as multidrug-resistant (MDR) bacteria. Virulence factors were studied and hemolysis was detected in 11% of representative isolates from 2016, 6% from 2017 and 12% in isolates from 2018 cheeses. Furthermore, only two positive results for gelatinase were found in 2017 representative isolates. In conclusion, our results showed that no pattern of bacterial enumeration or microbiome diversity is present throughout different years of production in artisanal cheeses such as the ones studied. Moreover, although alarming resistances were found in enterococci no multi-drug resistance isolates were observed. Further work should be performed to continue the characterization of the pathogenic potential of isolates present in these cheeses.
Descrição
Tese de mestrado, Microbiologia Aplicada, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2019
Palavras-chave
Queijo tradicional Português Denominação de origem protegida Bactérias ácido lácticas Diversidade de microbioma Resistência a antibióticos Teses de mestrado - 2019