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Publicação
Computational modeling of TGF-𝜷 signaling
| Nome: | Descrição: | Tamanho: | Formato: | |
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Orientador(es)
Resumo(s)
O fator de transformação do crescimento beta ou TGF-β é uma citocina que consta nos 33 membros da superfamília do TGF-β, envolvida em processos fundamentais da célula, nomeadamente na proliferação, migração, diferenciação das células e apoptose celular, assim como na homeostasia dos tecidos. Consequentemente, o mau funcionamento da via de sinalização do TGF-β está associado a diferentes patologias. Tendo em conta este facto e a grande diversidade de respostas biológicas por si originadas, esta cascata de sinalização é um grande alvo de pesquisas, da parte de diversos autores, através da implementação de diversos modelos computacionais. A morfologia da célula não é tida em conta na implementação da maioria dos modelos correntes da via de sinalização canónica do TGF-β. Porém, esta característica celular é normalmente vista como uma medida de grande relevância para ditar o modo como a célula responde a estímulos mecânicos externos. A resposta das células ao ambiente extracelular, caracterizada pela conversão de estímulos mecânicos em sinas bioquímicos, tem a designação de mecanotrasdução. As integrinas, que são uma família de receptores de sinais e de adesão células, convertem estímulos mecânicos em sinais bioquímicos, constituindo um meio de comunição entre as células e o ambiente extracelular. Deste modo, as interacções entre a via de sinalização do TGF-β e as integrinas constituem uma forma de mecanotransdução. Um entendimento mais profundo da dinâmica da via de sinalização do TGF-β através de um modo dependente da morfologia da célula e um entendimento do papel que o crosstalk entre as integrinas e a via de sinalização canónica do TGF-β tem sobre a expressão genética permitem, consequentemente, perceber melhor a conexão entre esta via e o comportamento celular perante estímulos mecânicos. Tal conhecimento detém o potencial para prever interações entre as células e biomateriais e poderá, possivelmente, ser aplicado a diferentes terapias, tais como terapias associadas ao controlo do desenvolvimento de tumores.
Devido às razões previamente referidas, neste trabalho é apresentado um novo modelo computacional para a via de sinalização canónica do TGF-β, contendo um módulo de crosstalk com as integrinas. O modelo construído é espacial, sendo implementado através de equações diferenciais parciais. As equações utilizadas são do tipo reação-difusão. Os principais objectivos do presente trabalho são avaliar o impacto que a morfologia da célula detém sobre a sinalização downstream e perceber qual é a influência da crosstalk entre a via de sinalização canónica do TGF-β e as integrinas sobre a expressão genética. Deste modo, o modelo implementado neste trabalho divide-se em dois módulos – Módulo I e Módulo II. O modelo standard, que consiste no modelo da via de sinalização canónica do TGF-β, corresponde ao Módulo I. O Módulo I do modelo foi construído com base em dois artigos: Claus et al., 2013 e Nicklas & Saiz, 2013. As equações que envolvem as diferentes espécies da via de sinalização canónica do TGF-β, assim como as condições de fronteira aplicáveis às membranas citoplasmática e nuclear, foram adaptadas de Claus et al., 2013, e a secção do modelo respeitante ao trafficking de receptores foi adaptado de Nicklas e & Saiz, 2013. As equações de reação-difusão implementadas no Módulo I traduzem os passos gerais da cascata de sinalização do TGF-β referidos por diversos autores: os recetores do TGF-β são ativados pelo ligando TGF-β, recrutando e fosforilando o Smad2/3 junto à membrana citoplasmática. O Smad2/3 fosforilado, pSmad2/3, pode associar-se ao Smad mediador, o Smad4, formando um complexo, o pSmad2/3 + Smad4. Este complexo migra para o núcleo, onde se associa ao DNA, induzindo expressão genética. Quando o pSmad2/3 não se associa ao Smad4, pode migrar diretamente para o núcleo, tal como moléculas de Smad2/3 e moléculas de Smad4 podem deslocar-se até ao núcleo sem estarem associadas a outras espécies. O processo de formação do complexo pSmad2/3 + Smad4 também pode ocorrer no núcleo da célula. O Módulo II do modelo diz respeito à implementação de diferentes interações de crosstalk entre as integrinas e a via de sinalização do TGF-β. As interações de crosstalk incluídas neste módulo são: 1) A upregulation dos recetores do TGF-β despoletada pelas integrinas; 2) O aumento da constante catalítica da reacção de fosforilação do Smad2/3 mediada pelo complexo formado pelo TGF-β e os seus recetores, complexo C, sendo este aumento despoletado pelas integrinas; 3) A estabilização dos recetores do TGF-β despoletada pelas integrinas, resultando na diminuição da taxa de degradação do complexo C; 4) A formação de um complexo composto pelas integrinas e pelo complexo C, complexo IC, que se liga ao Smad2/3, provocando um aumento da constante catalítica da reação de fosforilação do Smad2/3. Foram realizadas diferentes experiências in silico para atingir os objetivos previamente referidos. Relativamente ao Módulo I, de modo a avaliar o impacto da morfologia celular sobre a expressão genética induzida pelo TGF-β, foram feitas simulações para diferentes geometrias da célula, nomeadamente para elipses e rectângulos com diferentes rácios de largura e altura. Foram ainda realizadas simulações para diferentes áreas da célula, num intervalo de valores que se estende desde a área estabelecida no modelo standard até 10 vezes a área do modelo standard. A avaliação do impacto da área da célula a nível downstream é realizada para as geometrias acima referidas. Adicionalmente, os parâmetros do modelo foram submetidos a uma análise de sensibilidade. No que diz respeito ao Módulo II, realizaram-se diferentes simulações para diferentes tipos de crosstalk que se estabelecem entre as integrinas e a via de sinalização do TGF-β para perceber a influência que um aumento dos parâmetros associados a cada tipo de crosstalk possui sobre a concentração do complexo pSmad2/3 + Smad4 no núcleo. Esta incrementação dos valores atribuídos a cada parâmetro é feita de modo independente ou para dois ou três parâmetros em simultâneo. A análise das diferentes simulações realizadas, com o intuito de avaliar apenas o impacto da geometria da célula, indica que a espécie participante desta via de sinalização que mais sofre discrepâncias na sua concentração nuclear por rácio largura/altura, devido a mudanças na geometria da célula, é o Smad2/3. As restantes espécies, nomeadamente o pSmad2/3, o complexo pSmad2/3 + Smad4 e o Smad4, sofrem discrepâncias idênticas por unidade de rácio largura/altura. Constatou-se que existe uma tendência de decréscimo na concentração nuclear do Smad2, pSmad2/3 e complexo pSmad2/3 + Smad4 com o aumento do rácio largura/altura da célula. Por outro lado, constatou-se um aumento da concentração nuclear do Smad4 por unidade de rácio largura/altura. As simulações efectuadas para avaliar o efeito que as dimensões da célula possuem sobre a cascata do TGF-β, a nível downstream, indicam que com o aumento do tamanho da célula, existe diminuição da concentração do complexo pSmad2/3 + Smad4 no núcleo da célula, havendo um declínio na expressão genética. Esta conclusão é aplicável a todas as geometrias da célula consideradas. Concretamente, considerando a passagem da área standard da célula para uma área 10 vezes superior, constata-se uma diminuição de cerca de 50% na concentração nuclear do complexo pSmad2/3 + Smad4 para todos os formatos da célula. Ainda relativamente a resultados do Módulo I, os diversos parâmetros do modelo foram submetidos a uma análise de sensibilidade que revelou que a concentração do complexo pSmad2/3 + Smad4 no núcleo é mais sensível às reacções do modelo do que a processos de difusão. No entanto, um decréscimo de 100% do valor dos parâmetros de difusão revela uma sensibilidade considerável a nível downstream da via de sinalização, o que sugere que ainda assim os parâmetros de difusão devem ser incluídos em modelos que visem estudar a dinâmica da cascata do TGF-β. As simulações realizadas para estudar o efeito da crosstalk entre as integrinas e a via de sinalização do TGF-β sugerem que de todos os tipos de interação implementados no modelo construído, o tipo de interação que causa maior upregulation da concentração nuclear do complexo pSmad2/3 + Smad4 é o decréscimo da taxa de degradação dos receptores devido à estabilização dos receptores do TGF-β por parte das integrinas. Por outro lado, o tipo de interacção de crosstalk que menos contribui para a expressão genética é o aumento da constante catalítica de fosforilação do Smad2/3 mediada pelo complexo IC. Em adição, a expressão genética sofreu mais upregulation, em geral, quando houve uma intensificação simultânea dos efeitos de dois tipos de crosstalk com as integrinas, comparativamente com uma forma de crosstalk ou três tipos de interação em conjunto. Os próximos passos associados ao trabalho apresentado neste documento são o estabelecimento de um conjunto de experiência in vitro para analisar o efeito da morfologia da célula e da mecanotransdu-ção, com o intuito de validar os resultados e conclusões obtidos através do conjunto de experiências in silico. Adicionalmente, outras formas de crosstalk entre as integrinas e a cascata do TGF-β deverão ser incluídas no modelo, tais como a interação da via de sinalização com proteínas reguladas pela actina-G e actina-F do citoesqueleto da célula. Estas proteínas são libertadas quando existe remodelação do cito-esqueleto e um desequilíbrio nos seus níveis resulta na expressão de receptores de ligandos da família TGF-β.
The TGF-β is a cytokine involved in fundamental cell processes, such as cell migration, proliferation and apoptosis. A deeper insight into the dynamics of the TGF-β pathway through a cell morphology-dependent manner and into the role that the crosstalk with the integrins has upon downstream signaling of this pathway allows a better understanding of the link between the TGF-β pathway and mechanotransduction cues, therefore holding the potential to uncover interactions between biomaterials and cells and apply this knowledge to different therapies. In this document, a spatial computational model for the canonical TGF-β pathway is presented, including a module for the crosstalk with the integrins. The equations used to model this system are partial differential equations of the reaction-diffusion type. The model was created to evaluate the impact of cell shape and size, as well as crosstalk with the integrins, on genetic expression. The results of the experiments suggest that a bigger width/height ratio of the cell induces less con-centration of the nuclear Smad2/3, nuclear phosphorylated Smad2/3 and nuclear phosphorylated Smad2/3 + Smad4 complex, for elliptical and rectangular cell shapes. Conversely, the concentration of the nuclear Smad4 increases as the width/height ratio of the cell increases, for elliptical and rectangular cell shapes. The nuclear species of the TGF-β pathway that suffers more variation in its nuclear concentration across cell shapes is the Smad2/3. Considering a range of values that go up to 10 times the original area of the cell for different cell shapes, as the area of the cell increases, the concentration of the nuclear phosphorylated Smad2/3 + Smad4 complex decreases by approximately 50%. Sensitivity analysis of the model parameters indicate that genetic expression elicited by the TGF-β when considering diffusive processes differs considerably from results without considering this phenomenon. It is suggested that the way of crosstalk which more heavily increases genetic expression is the decrease of the degradation rate of the receptors due to stabilization from the integrins. Experimental procedures also suggest that the concentration of the nuclear phosphorylated Smad2/3 + Smad4 complex undergoes more upregulation, in general, by the joint behavior of two ways of crosstalk interaction than by the effects of one way of crosstalk independently or the combination of three ways of crosstalk out of the considered interactions.
The TGF-β is a cytokine involved in fundamental cell processes, such as cell migration, proliferation and apoptosis. A deeper insight into the dynamics of the TGF-β pathway through a cell morphology-dependent manner and into the role that the crosstalk with the integrins has upon downstream signaling of this pathway allows a better understanding of the link between the TGF-β pathway and mechanotransduction cues, therefore holding the potential to uncover interactions between biomaterials and cells and apply this knowledge to different therapies. In this document, a spatial computational model for the canonical TGF-β pathway is presented, including a module for the crosstalk with the integrins. The equations used to model this system are partial differential equations of the reaction-diffusion type. The model was created to evaluate the impact of cell shape and size, as well as crosstalk with the integrins, on genetic expression. The results of the experiments suggest that a bigger width/height ratio of the cell induces less con-centration of the nuclear Smad2/3, nuclear phosphorylated Smad2/3 and nuclear phosphorylated Smad2/3 + Smad4 complex, for elliptical and rectangular cell shapes. Conversely, the concentration of the nuclear Smad4 increases as the width/height ratio of the cell increases, for elliptical and rectangular cell shapes. The nuclear species of the TGF-β pathway that suffers more variation in its nuclear concentration across cell shapes is the Smad2/3. Considering a range of values that go up to 10 times the original area of the cell for different cell shapes, as the area of the cell increases, the concentration of the nuclear phosphorylated Smad2/3 + Smad4 complex decreases by approximately 50%. Sensitivity analysis of the model parameters indicate that genetic expression elicited by the TGF-β when considering diffusive processes differs considerably from results without considering this phenomenon. It is suggested that the way of crosstalk which more heavily increases genetic expression is the decrease of the degradation rate of the receptors due to stabilization from the integrins. Experimental procedures also suggest that the concentration of the nuclear phosphorylated Smad2/3 + Smad4 complex undergoes more upregulation, in general, by the joint behavior of two ways of crosstalk interaction than by the effects of one way of crosstalk independently or the combination of three ways of crosstalk out of the considered interactions.
Descrição
Tese de mestrado integrado em Engenharia Biomédica e Biofísica (Engenharia Clínica e Instrumentação Médica), Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2020
Palavras-chave
Sinalização do TGF-β Morfologia da célula Integrinas Mecanotransdução Crosstalk Teses de mestrado - 2020