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Publicação
Nitrification control: how do the natural ecosystem do it?
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Orientador(es)
Resumo(s)
O ciclo do N, composto por diversas etapas, é mediado principalmente por microrganismos. Os microrganismos diazotróficos fixam Azoto (N2), introduzindo-o na biosfera. Os compostos orgânicos azotados são depois mineralizados, em ambientes aeróbios, a amónia. Esta é rapidamente oxidada a nitrito (NO2-) e nitrato (NO3-) pelos microrganismos oxidantes de amónia (AOM) e oxidantes de nitrito (NOM), processo denominado de nitrificação. Em ambientes anaeróbios, pode ocorrer a desnitrificação com a redução do nitrato a óxido nítrico (NO), óxido nitroso (N2O) e azoto molecular (N2) (Bock and Wagner, 2006). Um equilíbrio da forma e quantidade de N nos ecossistemas é vital, pois o ecossistema pode perder fertilidade com reduzida quantidade de N, mas pode sofrer eutrofização com elevadas concentrações de N. O ciclo do Azoto pode não ocorrer linearmente, sendo a resposta da comunidade microbiana responsável pelos processos de oxi-redução do azoto dependente das condições do ecossistema, tal como, a taxa de conversão de cada processo dependente do controlo da atividade microbiana, afeta a disponibilidade e a forma de azoto no ecossistema. Com excesso de N na forma orgânica, deverá haver um aumento na atividade de mineralização, seguido de nitrificação e desnitrificação, resultando na libertação de N para a atmosfera. Esta situação ocorre, se existirem condições ótimas para todos os processos, no entanto, o aumento da concentração de amónia, nitrito, nitrato, ou outros compostos resultantes dos processos oxi-redutivos do ciclo do azoto, no solo, pode ocorrer se as condições necessárias para um dos processos não se verificarem. A nitrificação é o processo de oxidação da amónia a nitrito e nitrito a nitrato, catalisado por 2 grupos de organismos distintos (Norton and Stark, 2011; Fienck et al. 2005; Sinha and Annachhatre, 2007), sendo a oxidação da amónia considerado o passo limitante da nitrificação. A oxidação da amónia é catalisada por diversos grupos, sendo as bactérias e árqueas quimiolitotróficas oxidantes de amónia (AOB e AOA respetivamente) os principais intervenientes em ambientes terrestres aeróbios (Norton and Stark, 2011; Sinha and Annachhatre, 2007). As bactérias oxidantes de amónia (AOB) quimiolitotróficas são membros das classes β ou γ de Proteobacteria. Nas β-proteobacteria existem 4 géneros diferentes, Nitrosomonas, Nitrosospira, Nitrosolobus e Nitrosovibrio. O género Nitrosococcus pertence às γ-Proteobacteria (Purkhold et al. 2000). As AOB estão distribuídas por diversos ambientes costeiros, marinhos e ambientes polares (maioritariamente 2 clusters, Nitrosomonas e Nitrosospira), ambientes salinos ou hipersalinos (Nitrosomonas), condições com temperaturas elevadas (Nitrosospira) e ambientes acídicos (Nitrosomonas) (Junier et al. 2010; Prosser and Nicol, 2008). AOB são bactérias litoautotróficas, tendo como substrato principal a amónia (NH3), e como dador de eletrões a hidroxilamina. A oxidação da amónia é catalisada pela enzima amónia monoxigenase (AMO), produzindo hidroxilamina, sendo esta oxidada a nitrito pela enzima hidroxilamina oxiredutase (HAO) (Bock and Wagner, 2006; Hatzenpichler, 2012). As árqueas oxidantes de amónia (AOA), pertencentes ao novo filo Thaumarchaeota (Norton and Stark, 2011; Hatzenpichler, 2012) aparentam estar presentes em diversos ambientes mesofilicos (marinhos, água-doce e terrestres) assim como em condições extremas (ambientes acidófilos, termófilos, águas profundas e fontes termais) (Junier et al. 2010; Nicol and Schleper, 2006). A via metabólica das AOA é pouco conhecida, não tendo sido ainda identificado nenhum homologo da enzima HAO (Hatzenpichler, 2012; He et al. 2012). No entanto, parecem ter a capacidade de utilizar fontes orgânicas de energia como aminoácidos (He et al. 2012; Tourna et al. 2011; Hatzenpichler, 2012). A enzima AMO das AOA, comparativamente à AMO das AOB, tem uma maior afinidade para a amónia, podendo ter as AOA uma maior contribuição para a atividade nitrificante em ambientes oligotróficos (He et al. 2012; Martens-Habbena et al. 2009). A importância da nitrificação baseia-se no facto de ser o único processo biológico oxidativo que liga fontes de azoto inorgânico reduzido (amónia) e oxidado (nitrito e nitrato) (Martens-Habbena et al. 2009; Norton and Stark, 2011; Fienck et al. 2005; Sinha and Annachhatre, 2007). Nitrito, o produto da oxidação da amónia, é normalmente encontrado em baixas concentrações nos solos devido à sua toxicidade, sendo essencial manter uma baixa concentração (Bock and Wagner, 2006; Norton and Stark, 2011; Cleemput and Samater, 1996). Para além do nitrito, o óxido nítrico e óxido nitroso também podem ser produzidos através da redução do nitrito pela nitrito redutase (NIR) presente em algumas bactérias oxidantes de amónia (Bremner, 1997; Burns et al. 1996). Além de promoverem a acidificação do solo com a formação de ácidos, o óxido nitroso age como um gás com efeito de estufa, 310x mais potente que o dióxido de carbono (Yamanaka, 2008; Bock and Wagner, 2006; Hatzenpichler, 2012). O nitrato pode ser utilizado como fonte de azoto por diversos organismos, e em excesso pode causar eutrofização desse ecossistema. Sendo facilmente lixiviado pode causar a contaminação de águas subterrâneas (Fienck et al, 2005). Tendo a nitrificação uma forte influência no fluxo de azoto nos sistemas terrestres e marinhos, e os seus produtos importantes na determinação da qualidade de solos e águas, o estudo da influência dos fatores bióticos e abióticos no controlo da atividade nitrificante e crescimento dos organismos nitrificantes é essencial. Existem diversos fatores estudados que influenciam o crescimento e atividade das comunidades oxidantes de amónia. Um dos principais fatores é a concentração de substrato, neste caso, amónia. Como foi referido, o aumento da concentração de N no ecossistema pode levar a um aumento da atividade nitrificante, dependendo da suscetibilidade das estirpes de AOB ao substrato e a sua adaptação ao aumento da amónia. Este aumento de atividade é problemática se houver acumulação de nitrito, nitrato ou outros produtos resultantes dessa atividade. A acumulação de nitrito ocorre em condições favoráveis à oxidação da amónia desfavoráveis à oxidação de nitrito e desnitrificação, como, ambientes bem oxigenados e condições alcalinas ou com pH neutro (Fienck et al. 2005), sendo as AOB muito suscetíveis a alterações no pH. Logo, a oxigenação dos solos e pH são outros fatores a ter em conta. Em ambientes pouco oxigenados (condições de microaerofilia) a formação de óxidos nitroso e nítrico é estimulada (Fienck et al. 2005; Bock and Wagner, 2006). Em solos carbonatados a produção de óxidos é reduzida pela interação química com os carbonatos, formando nitrito e nitrato. (Bock and Wagner, 2006). A produção de nitritos pode ser inibida pela presença de compostos orgânicos (Adair and Schwartz, 2008), no entanto algumas espécies de AOB podem crescer mixotroficamente (amónia e C orgânico como fonte de energia, podendo haver produção de nitritos) com compostos como piruvato ou acetato, ou organotroficamente (C orgânico como fonte de energia, sem produção de nitritos) com açúcares. Contudo a nitrificação pode ser importante e benéfica para algumas plantas que utilizem preferencialmente o nitrato (Bock and Wagner, 2006), logo em ambientes pobres em nitrato a nitrificação pode ser estimulada pelas plantas. Assim, fatores a considerar para o estudo de populações de microrganismos oxidantes de amónia são nicho (solo rizosférico ou superfície das raízes), a adaptação à adição de N no solo, a concentração de substrato, pH das culturas e presença de matéria orgânica. Tendo em vista o estudo da comunidade oxidante de amónia (Bactérias e Árqueas) num ecossistema mediterrânico os principais objetivos deste trabalho foram: 1. Estudar a localização preferencial da comunidade oxidante de amónia (solo rizosférico ou superfície das raízes de Cistus ladanifer) 2. Estudar o efeito da adição de N no solo, na atividade e estrutura das comunidades oxidantes de amónia 3. Estudar o efeito da concentração de substrato (amónia), pH e presença de compostos orgânicos azotados/ glucose / acetato em culturas de AOB provenientes de solos com e sem adição de N. Num ecossistema mediterrâneo, pobre em nutrientes, os nichos preferenciais para o crescimento de microrganismos oxidantes de amónia deverão estar localizados perto da raiz das plantas, ou na superfície das raizes, proporcionando uma maior troca de nutrientes entre planta-microrganismos (Ochua-Hueso et al, 2011), além de facultar condições de oxigenação, pH e conteúdo em água favoráveis para o crescimento e atividade de oxidantes de amónia. Sendo os solos pobres em azoto e matéria orgânica (Dias et al. 2012), espera-se encontrar populações de AOB mais adaptadas a ambientes oligotróficos. No entanto, em solos com frequente adição de N ao longo de 6 (desde 2007), o aumento da disponibilidade de N na forma de amónia, deverá determinar adaptação das populações de AOB, aumentando a atividade oxidante de amónia, e alterando a comunidade ao nível estrutural. Em relação ao efeito da concentração de amónia nas culturas de AOB, populações de AOB adaptadas a baixas concentrações de amónia no solo, deverão ser mais suscetíveis a elevadas concentrações de amónia, comparativamente com populações de AOB adaptadas a maiores concentrações de amónia, ou seja provenientes de solos com frequente adição de azoto. Relativamente ao efeito do pH, espera-se que populações com maior atividade nitritante sejam mais tolerantes à acidificação, uma vez que o aumento da atividade leva a uma diminuição do pH, podendo resultar ou não na acidificação do solo, dependendo da composição deste. No efeito de compostos orgânicos nas culturas de AOB, espera-se que haja menor atividade com fontes energéticas orgânicas (para crescimento mixotrófico ou organotrófico), uma vez que AOB adaptadas a ambientes oligotróficos prefiram fontes energéticas e de carbono inorgânicas, como amónia e CO2. Para o estudo de microrganismos oxidantes de amónia, amostras de solo foram recolhidas de um campo experimental, localizado no Parque Natural da Serra da Arrábida. Plantas de Cistus ladanifer de solos sem adição de azoto foram recolhidas juntamente com solo rizosférico a 5-6 cm de profundidade, em julho para estudar o nicho preferencial das AOM. Solo rizosférico e raízes lavadas com água destilada foram utilizadas como inoculo para crescimento de AOB. Para o estudo do efeito da adição de N no solo, amostras de solo foram retiradas a 1 cm da raiz primária de Cistus ladanifer a 5-6 cm de profundidade dentro dos talhões dos 4 tratamentos: controlo (solo sem fertilização) e três diferentes adições de azoto: 40 e 80 kg de N /ha /y na forma de NH4NO3 (40AN e 80AN) e 40 kg de N/ ha /y na forma de NH4+ (40A). O solo foi utilizado como inoculo no crescimento de AOB e AOA. As populações de AOM foram seletivamente cultivadas por 30 (AOB) /60 (AOA) dias com 3 enriquecimentos sucessivos em meio SFC (Synthetic Freshwater Crenoarchaeota) (Konneke et al. 2005; De La Torre et al. 2008), de modo a assegurar a diluição de microrganismos heterotróficos e de matéria orgânica no inoculo de solo inicial. O meio foi suplementando de acordo com a especificidade para bactérias e/ou árqueas oxidantes de amónia (3 antibióticos diferentes). No 3º enriquecimento os meios e condições de incubação foram suplementados/alterados de acordo com o objectivo (fonte de azoto, carbono, concentração de amónia, pH). A atividade das comunidades oxidantes de amónia foi avaliado regularmente pela quantificação do produto final de nitrito, permitindo distinguir a cinética da produção de nitrito de cada cultura. A atividade de cada cultura foi estudada no 3º enriquecimento de modo a ter-se culturas de AOB sem contaminantes. A presença de árqueas e bactérias oxidantes de amónia foi confirmada pela amplificação do gene 16S rRNA e amoA, especifico para cada grupo. A estrutura das comunidades bacterianas oxidantes de amónia foi avaliado por PCR-RFLP fingerprinting, com as enzimas de restrição HinfI e HaeIII. A análise estatística dos dados foi efetuada em SPSS, versão 20 para Windows. Comparando o número de culturas ativas, taxa de produção de nitrito e concentração máxima de nitrito, uma localização preferencial de atividade das AOB foi observado no solo rizosférico de Cistus ladanifer. No entanto, não foi detetada a presença de AOA nas culturas. Relativamente ao efeito da adição de azoto no solo, verificou-se uma tendência para o aumento da atividade oxidante de amónia das populações de AOB. No entanto, a resposta da população ao aumento de N no solo depende da forma e quantidade de N aplicado. O controlo da atividade dependerá também da disponibilidade da amónia nos solos, havendo uma competição pelo substrato entre plantas e AOB (Verhagen et al. 1994), principalmente nos tratamentos com maior cobertura vegetal como o 40AN (Dias et al, 2011). Embora a presença de AOA não seja confirmada, as culturas de AOA provenientes de solos sem adição de azoto apresentaram uma maior atividade oxidante de amónia, indicando uma resposta das populações de AOA diferente das populações de AOB. Por PCR-RFLP verificou-se que a estrutura das populações de AOB é alterada com a adição de azoto no solo, tendo os resultados também demonstrado a heterogeneidade dos solos com o mesmo tratamento. Comparando os perfis de PCR-RFLP realizados in-silico para as espécies conhecidas do género Nitrosomonas e Nitrosospira e os perfis obtidos a partir das populações de AOB, Nitrosospira tenuis foi identificada nas populações de AOB de solos com adição de azoto. Nas populações de AOB foram observadas diferentes suscetibilidades a concentrações crescentes de amónia, tendo as comunidades AOB provenientes de solo sem adição de N uma maior suscetibilidade à amónia, comparativamente a populações de AOB de solos com adição de N. A atividade oxidante de amónia, com produção cumulativa de nitrito, das culturas de populações de AOB presentes em solos sem adição de N foi inibida pela presença de compostos orgânicos como peptona, glucose e acetato. No entanto, as populações de AOB parecem ter a capacidade de utilizar ureia como fonte energética em substituição da amónia. Considerando a influência dos fatores estudados: nicho preferencial, adição de N no ecossistema, concentração de substrato, pH e presença de compostos orgânicos na atividade das populações de AOB, estas demostraram ser suscetíveis a alterações, não são resilientes e não aparentam ter redundância funcional (não têm o mesmo nível de atividade). Mas a influência que os fatores exercem sobre a população nitrificante é necessária para controlar essa atividade, de modo a que não haja perda de N no sistema. A adição de N no solo não implica necessariamente um aumento da atividade nitritante, se este N não estiver em excesso. No entanto, N em excesso aumentará a atividade nitrificante, com consequente diminuição da quantidade de N inorgânico no solo. Este aumento de atividade levará a uma diminuição no pH, particularmente em solos sem um forte efeito tampão, o que leva a uma inibição da nitrificação. O aumento de nitrito leva também ao aumento de nitrato (oxidação do nitrito a nitrato), e ao consequente aumento da biomassa e compostos orgânicos no solo, inibindo a atividade de AOB sensíveis a matéria orgânica. Diminuindo a oxidação da amónia haverá novamente o aumento de N inorgânico no solo, de modo a não haver perda de N e consequente perda de fertilidade do solo. Esta regulação é mantida devido à sensibilidade apresentada pelas populações de AOB a estes fatores, sendo essencial para o equilíbrio de N no ecossistema.
Nitrification is a fundamental and central step in the nitrogen cycle, linking the reduced and oxidized nitrogen pools, which processes are mostly accomplished by microorganisms. The first step is mainly done by ammonia oxidizing bacteria (AOB) and by ammonia oxidizing archaea (AOA). Regulation of nitrification activity is essential in ecosystem to maintain N balance, since N excess can cause eutrophication and production of toxic compounds, and N limitation can reduce soil fertility. Mediterranean ecosystem soils are poor in terms of N therefore microbial communities can be more susceptible to change when confronted with N input, pH change or presence of organic matter. This study aims to understand the niche preference, the impact of N addition in soils, pH, substrate (ammonia) concentration and presence of organic compounds in ammonia oxidizing populations from Mediterranean soils. Rhizospheric soil and root samples from Cistus Ladanifer were collected from an experimental field in which has been added 3 different N - treatments since 2007, in Serra da Arrábida Natural Park. By using serial culture enrichments and nitrite quantification through incubation time it was possible to quantify and study nitrifying activity. The presence of AOB and AOA in each enrichment was confirmed by PCR. AOB structural community’s change by N-addition in soils was assessed by PCR- RLFP. AOB susceptibility to ammonia, pH and organic compounds was studied by testing several ammonia concentrations in the medium, altering pH and supplementing the medium with organic compounds. As a preferential niche for AOB activity, AOB populations appear to be more abundant in rhizospheric soil of Cistus ladanifer. Soils with N-addition had altered AOB population with higher ammonia oxidizing activity and a different community structure. By comparing in silico PCR-RFLP profiles and the AOB profiles it was possible to identify Nitrosospira tenuis in the AOB population. Though the presence of AOA was not confirmed in any of the treatments, activity of possible AOA from soils without N –addition was higher, than of AOA from soils with N-addition. AOB activity appeared to be influenced by the substrate concentration, with AOB from soils with N-addition being less susceptible to change in substrate concentration. AOB cultures appear to be susceptible to pH, having an activity inhibition with pH above 7 and under 6. The populations are also sensible to the presence of organic matter, however, being capable of using urea as a substrate for ammonia in litotrophic growth and nitrite production activity. It was observed that ammonia oxidation activity can be stimulated by N-addition, altering not just the activity but also the population structure to have a higher tolerance to the substrate. While ammonia oxidising activity is inhibited by pH changes and presence of organic matter.
Nitrification is a fundamental and central step in the nitrogen cycle, linking the reduced and oxidized nitrogen pools, which processes are mostly accomplished by microorganisms. The first step is mainly done by ammonia oxidizing bacteria (AOB) and by ammonia oxidizing archaea (AOA). Regulation of nitrification activity is essential in ecosystem to maintain N balance, since N excess can cause eutrophication and production of toxic compounds, and N limitation can reduce soil fertility. Mediterranean ecosystem soils are poor in terms of N therefore microbial communities can be more susceptible to change when confronted with N input, pH change or presence of organic matter. This study aims to understand the niche preference, the impact of N addition in soils, pH, substrate (ammonia) concentration and presence of organic compounds in ammonia oxidizing populations from Mediterranean soils. Rhizospheric soil and root samples from Cistus Ladanifer were collected from an experimental field in which has been added 3 different N - treatments since 2007, in Serra da Arrábida Natural Park. By using serial culture enrichments and nitrite quantification through incubation time it was possible to quantify and study nitrifying activity. The presence of AOB and AOA in each enrichment was confirmed by PCR. AOB structural community’s change by N-addition in soils was assessed by PCR- RLFP. AOB susceptibility to ammonia, pH and organic compounds was studied by testing several ammonia concentrations in the medium, altering pH and supplementing the medium with organic compounds. As a preferential niche for AOB activity, AOB populations appear to be more abundant in rhizospheric soil of Cistus ladanifer. Soils with N-addition had altered AOB population with higher ammonia oxidizing activity and a different community structure. By comparing in silico PCR-RFLP profiles and the AOB profiles it was possible to identify Nitrosospira tenuis in the AOB population. Though the presence of AOA was not confirmed in any of the treatments, activity of possible AOA from soils without N –addition was higher, than of AOA from soils with N-addition. AOB activity appeared to be influenced by the substrate concentration, with AOB from soils with N-addition being less susceptible to change in substrate concentration. AOB cultures appear to be susceptible to pH, having an activity inhibition with pH above 7 and under 6. The populations are also sensible to the presence of organic matter, however, being capable of using urea as a substrate for ammonia in litotrophic growth and nitrite production activity. It was observed that ammonia oxidation activity can be stimulated by N-addition, altering not just the activity but also the population structure to have a higher tolerance to the substrate. While ammonia oxidising activity is inhibited by pH changes and presence of organic matter.
Descrição
Tese de mestrado. Biologia (Microbiologia Aplicada). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2013
Palavras-chave
Ciclo do azoto Amonia Nitritos Solo Teses de mestrado - 2013