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Publicação
The RNA 5’ phosphatase PIR-1 cooperates with dicer to produce endogenous small RNAs and suppress viral replication in C. elegans
| Nome: | Descrição: | Tamanho: | Formato: | |
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| Tese | 11.04 MB | Adobe PDF | ||
| Apêndice D | 425.36 KB | Microsoft Excel XML |
Orientador(es)
Resumo(s)
Most organisms utilize small RNAs (sRNA) to control diverse aspects of development, reproduction and physiology by regulating gene expression at the transcriptional and post-transcriptional levels. The essential ribonuclease Dicer is a key enzyme in the production of several types of sRNAs. Prior work on the nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) has uncovered PIR-1 – a small protein conserved in all metazoans – as an interacting partner of Dicer in vivo. The human ortholog of PIR-1 has RNA 5' tri- and diphosphatase activities in vitro, but its biological role remains unclear. With the intent of finding its function, we characterized various aspects of C. elegans PIR-1. We found this enzyme to be essential for general growth and development, germline proliferation, and sperm maturation. We confirmed that PIR-1 associates with Dicer in vivo and expanded its repertoire of known interactions. Profiling of sRNAs from pir-1 loss-of-function animals by high-throughput sequencing revealed that PIR-1 is required for the production of 26G-RNAs during spermatogenesis, a class of Dicer-dependent sRNAs. 26G-RNAs are essential to promote appropriate sperm development, in agreement with the pir-1 mutant sperm defect. Additionally, we discovered a second, 26G-RNA-independent role for PIR-1, in which it cooperates with Dicer and other canonical RNA interference (RNAi) pathway components to suppress the replication of the C. elegans Orsay RNA virus. By demonstrating that PIR-1 functions as its human counterpart in vitro, and that a pir-1 transgene with a mutated phosphatase active site cannot rescue any of the mutant defects, we concluded that PIR-1 acts as an RNA phosphatase in vivo. This is the first study in which concrete biological functions are assigned to this enzyme. Given its high degree of conservation, these results provide a solid basis for studies on the multiple functions of PIR-1 in more complex animals.
A maioria dos organismos utiliza pequenos RNAs (sRNA) para controlar diversos aspectos do seu desenvolvimento, reprodução e fisiologia, através da regulação da expressão génica ao nível transcricional e pós-transcricional. A ribonuclease essencial Dicer desempenha um papel central na produção de vários tipos de sRNAs. Um estudo anterior realizado no nemátode Caenorhabditis elegans (C. elegans) revelou que PIR-1 – uma pequena proteína conservada em todos os metazoários – se associa à Dicer in vivo. A proteína ortóloga humana PIR1 funciona in vitro como uma tri- e di-fosfatase 5' de RNA. A sua função biológica, porém, não é clara. Com o objectivo de encontrar a sua função, procedemos à caracterização da PIR-1 de C. elegans. Esta enzima é essencial para o desenvolvimento geral e crescimento, proliferação da linha germinal e para a maturação de espermatozóides. Neste estudo comprovámos a interacção entre PIR-1 e Dicer in vivo, e expandimos o repertório de proteínas com as quais a PIR-1 se associa. Sequenciação “high-throughput” dos sRNAs de um mutante de pir-1, revelou que esta proteína é necessária, juntamente com a Dicer, para a produção de 26G-RNAs, que promovem a espermatogénese. Adicionalmente, descobrimos que em cooperação com a Dicer e outros componentes da via da interferência por RNA (RNAi), a PIR-1 suprime a replicação do vírus Orsay, que infecta especificamente C. elegans. Ao demonstrar que a PIR-1 possui a mesma actividade que a proteína humana in vitro, e que um transgene de pir-1 com o centro catalítico inactivo não permite a supressão de nenhum dos defeitos do mutante, concluímos que a PIR-1 funciona como uma fosfatase de RNA in vivo. Este é o primeiro estudo a atribuir funções biológicas a esta enzima. Dada a sua conservação, estes resultados formam uma base sólida para estudos futuros sobre as múltiplas funções da fosfatase PIR-1 em animais de maior complexidade.
A maioria dos organismos utiliza pequenos RNAs (sRNA) para controlar diversos aspectos do seu desenvolvimento, reprodução e fisiologia, através da regulação da expressão génica ao nível transcricional e pós-transcricional. A ribonuclease essencial Dicer desempenha um papel central na produção de vários tipos de sRNAs. Um estudo anterior realizado no nemátode Caenorhabditis elegans (C. elegans) revelou que PIR-1 – uma pequena proteína conservada em todos os metazoários – se associa à Dicer in vivo. A proteína ortóloga humana PIR1 funciona in vitro como uma tri- e di-fosfatase 5' de RNA. A sua função biológica, porém, não é clara. Com o objectivo de encontrar a sua função, procedemos à caracterização da PIR-1 de C. elegans. Esta enzima é essencial para o desenvolvimento geral e crescimento, proliferação da linha germinal e para a maturação de espermatozóides. Neste estudo comprovámos a interacção entre PIR-1 e Dicer in vivo, e expandimos o repertório de proteínas com as quais a PIR-1 se associa. Sequenciação “high-throughput” dos sRNAs de um mutante de pir-1, revelou que esta proteína é necessária, juntamente com a Dicer, para a produção de 26G-RNAs, que promovem a espermatogénese. Adicionalmente, descobrimos que em cooperação com a Dicer e outros componentes da via da interferência por RNA (RNAi), a PIR-1 suprime a replicação do vírus Orsay, que infecta especificamente C. elegans. Ao demonstrar que a PIR-1 possui a mesma actividade que a proteína humana in vitro, e que um transgene de pir-1 com o centro catalítico inactivo não permite a supressão de nenhum dos defeitos do mutante, concluímos que a PIR-1 funciona como uma fosfatase de RNA in vivo. Este é o primeiro estudo a atribuir funções biológicas a esta enzima. Dada a sua conservação, estes resultados formam uma base sólida para estudos futuros sobre as múltiplas funções da fosfatase PIR-1 em animais de maior complexidade.
Descrição
Tese de doutoramento, Ciências Biomédicas (Ciências Biopatalógicas), Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2015
Palavras-chave
Caenorhabditis elegans Vírus RNA Interferência de RNA Fosfatases Teses de doutoramento - 2015