Publicação
How Lama2-deficiency impacts myoblast differentiation in a mouse model for LAMA2-congenital muscular dystrophy
| datacite.subject.fos | Ciências Naturais::Ciências Biológicas | pt_PT |
| dc.contributor.advisor | Thorsteinsdottir, Sólveig | |
| dc.contributor.advisor | Carlos, Ana Rita | |
| dc.contributor.author | Ribeiro, Vanessa Filipa Laranjeiro | |
| dc.date.accessioned | 2022-12-26T16:44:38Z | |
| dc.date.available | 2022-12-26T16:44:38Z | |
| dc.date.issued | 2022 | |
| dc.date.submitted | 2022 | |
| dc.description | Tese de Mestrado, Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento, 2022, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências | pt_PT |
| dc.description.abstract | A matriz extracelular (MEC) é uma complexa rede acelular presente em todos os tecidos e fornece um suporte físico para as células. Embora a sua composição seja variável e especifica dependendo do tecido, os principais constituintes são água, glicoproteínas (como colagénios, fibronectina e laminina), elastina, proteoglicanos e hialurano, que conjuntamente com outros componentes se designam de matrissoma. Existem dois tipos principais de MEC, a matriz intersticial de estrutura fibrosa ou semelhante a gel e a membrana basal que está em contacto com as células. A MEC tem a função de estabilização de células e tecidos, fornecendo substratos de adesão celular em fase sólida e ligando a MEC ao citoesqueleto das células via recetores transmembranares. A MEC desempenha também um papel chave como reservatório de fatores de crescimento e moléculas bioativas que controlam os comportamentos e características fundamentais das células como sinalização, proliferação, adesão, migração, polaridade, diferenciação e apoptose. Mutações nos componentes da MEC, nas proteínas transmembranares ou em proteínas que liguem a MEC ao citoesqueleto das células musculares esqueléticas podem levar a distrofias musculares. As distrofias musculares congénitas representam um grupo de doenças que causam fraqueza (hipotonia) e atrofia muscular, sendo detetadas logo, ou pouco após a nascença. Estas são doenças geralmente hereditárias e associadas a mutações autossómicas recessivas. A distrofia muscular associada ao gene LAMA2 (LAMA2-CMD) é a distrofia muscular congénita mais comum e esta doença neuromuscular, tal como o nome indica, é desencadeada por mutações no gene LAMA2, que codifica para a cadeia α2 das lamininas 211/221, levando à redução da força muscular e a constrangimentos na regeneração muscular, sendo que atualmente não existe cura para esta doença. A ausência desta proteína leva a danos nas miofibras e a tentativa de reparação deste dano por regeneração, através das células estaminais musculares adultas (células satélite), não ocorre com sucesso. As fibras musculares entram em degeneração através da indução de apoptose, que é seguida de regeneração e inflamação crónica, e como consequência o tecido muscular é substituído por tecido fibrótico e adipócitos. Estudos anteriores do laboratório utilizando a estirpe de ratinho dyW, a qual é um dos modelos mais utilizados para o estudo de LAMA2-CMD, sugerem que a laminina 211 desempenha um papel importante durante o desenvolvimento e crescimento muscular normais durante o período fetal. Em particular, os resultados mostraram que entre os dias embrionários (E)17.5 e E18.5, portanto durante o período fetal, o número de células musculares estaminais (células Pax7 positivas) e mioblastos diferenciados (células miogenina positivas) torna-se reduzido em fetos dyW, em comparação com os controlos e verifica-se um atraso no crescimento muscular. Contudo, desconhece-se que mecanismos causam esta redução no crescimento muscular, que vias de sinalização são afetadas e se a proliferação e/ou diferenciação das células estaminais musculares esqueléticas e mioblastos são afetadas. Um dos objetivos deste projeto é compreender se a diferenciação de mioblastos está afetada na ausência de Lama2, e quais as vias envolvidas. Para tal foi utilizada uma linha celular de mioblastos, C2C12, na qual o gene Lama2 se encontra mutado, com o objetivo de estabelecer um modelo in vitro para LAMA2-CMD que pudesse ser utilizado para responder a esta questão. A análise de células mutadas para Lama2 permitiu revelar que a formação de miotubos fica comprometida nesta linha celular em comparação com a linha celular selvagem. Tendo feito esta observação, fulcral para o projeto, seguiu-se então o estudo de quais as vias responsáveis pelo defeito na diferenciação. Conhecida por ser responsável pela transição entre a miogénese embrionária e fetal, a via do Nfix foi um dos focos da análise das vias que afetam a diferenciação dos mioblastos, assim como a via da miogenina, que leva à diferenciação terminal dos mioblastos e a via Jak-Stat3, a qual desempenha um papel duplo na proliferação e diferenciação dos mioblastos. Os dados obtidos in vitro sugerem um aumento significativo dos níveis de expressão da proteína Nfix e uma diminuição dos níveis de expressão do gene Myog, que codifica para a miogenina, bem como uma desregulação na expressão génica dos genes alvo de ambas as proteínas. Os dados in vivo sugerem uma tendência para uma diminuição da expressão do gene Myog em amostras de musculo epaxial de ratinhos dyW e uma tendência para um aumento da expressão do gene Nfix no estádio E17.5, assim como uma desregulação na expressão dos seus genes alvo. No estádio E18.5 os dados sugerem uma tendência para uma diminuição da expressão do gene Nfix em amostras de músculo epaxial de ratinhos dyW. O eixo de sinalização RhoA/ROCK-Erk foi descrito como sendo importante na ativação do Nfix, e a proteína FAK como sendo importante para a diferenciação dos mioblastos através da ativação do fator regulatório miogénico MyoD e por isso estes fatores foram igualmente alvo de análise in vitro. Os níveis de expressão de P-FAK e P-Erk mostram uma tendência para aumento in vitro na ausência do gene Lama2, assim com in vivo, em amostras de musculo epaxial de ratinhos dyW, no estádio E17.5. Tendo em conta estudos recentes e os resultados obtidos de aumento da expressão de Nfix na ausência de Lama2, coloca-se a hipótese de que o aumento dos níveis de Nfix se deva a uma tentativa de controlo da sobrexpressão da proteína miostatina, a qual inibe a miogénese através da inibição da expressão de Myf5, um fator miogénico importante para o processo de diferenciação. Coincidente com a diferenciação comprometida nas linhas celulares C2C12 com o gene Lama2 silenciado, verificou-se uma retenção significativa de Myf5 no citoplasma comparando com as células musculares C2C12 selvagens. Contudo é necessário validar no futuro os níveis de expressão génica e proteica da miostatina. Como mencionado, a via Jak-Stat tem um papel importante na diferenciação dos mioblastos e os resultados obtidos mostram um aumento significativo da expressão da proteína de P-Stat3 in vitro, assim como uma tendência para um aumento in vivo no estadio E.17.5. Tal está de acordo com estudos anteriores do laboratório que mostraram um aumento de P-Stat3 no musculo fetal de ratinhos dyW, no estádio E17.5. Os dados obtidos indicam que a laminina 211 desempenha normalmente um papel na modulação da diferenciação dos mioblastos e a sua ausência leva á desregulação de algumas das vias importantes para a proliferação e diferenciação dos mioblastos. Os resultados sugerem também que a linha celular de mioblastos C2C12 sem o gene Lama2, pode ser um bom modelo in vitro para LAMA2-CMD, tendo em conta a semelhança com os resultados obtidos in vivo, em particular para as amostras de ratinho dyW, no estádio E17.5. Um outro objetivo deste projeto foi verificar o impacto da ausência de LAMA2 em linhas celulares tumorais de melanoma e cancro colorectal, uma vez que ambas foram descritas como tendo alterações na expressão de LAMA2. Tendo sido descrito como significativamente expresso em melanoma e cancro colorectal e promover a proliferação e migração, o gene ENO1 que codifica para a enolase alfa foi analisado e verifica-se uma tendência para diminuição de expressão nas linhas tumorais de melanoma, o que poderá indicar que na ausência de LAMA2, há uma diminuição na proliferação e migração. Tendo em conta os resultados obtidos nas células musculares esqueléticas verificou-se também os níveis de expressão da proteína P-Stat3 para a linha tumoral colorectal e verifica-se igualmente uma tendência para um aumento da sua expressão, na ausência de LAMA2. Os dados sugerem um ponto chave na ausência de LAMA2 nas MEC, sendo que independentemente do tipo celular e da doença há um aumento da expressão da proteína P-STAT3 quando há ausência da Laminina 211/221. Identificar estas vias e mecanismos é essencial para o desenvolvimento de terapias que tenham como alvo direto o início destas doenças. | pt_PT |
| dc.description.abstract | Extracellular matrices (ECMs) play a critical biochemical and structural role for cells and tissues. Their biochemical role is, for example, acting as a vehicle and reservoir for multiple factors, and their structural roles, help stabilize cells and tissues providing a solid-phase cell adhesion substrate. Mutations in ECM components can lead to the development of muscular dystrophies. Whether mutations in these components can impact other diseases, particularly, cancer, requires further studies. LAMA2-congenital muscular dystrophy (LAMA2-CMD) is a neuromuscular disease triggered by mutations in LAMA2, codifying the α2 chain of laminins 211/221, a structural component of basement membranes. Basement membranes are a specific type of ECM that is in direct contact with cells. When laminins 211/211 are absent, skeletal muscles display reduced muscle strength and failed muscle regeneration. Using the dyW mouse model for LAMA2-CMD, previous studies from the host laboratory indicated that laminin 211 may play an important role during normal muscle development and growth. Specifically, between embryonic day (E)17.5 and E18.5, the number of Pax7- and myogenin-positive cells becomes reduced in dyW fetuses compared to controls and their muscle growth lags behind. Here a C2C12 myoblast cell line lacking Lama2 was used to establish an in vitro model for LAMA2-CMD. This cell line was characterized by an impairment in myofiber formation when compared to the wildtype. With the aim of dissecting out how Lama2 affects myoblast differentiation, this project focused on studying the Nfix pathway, known to be responsible for the switch between embryonic and fetal myogenesis, and the myogenin pathway, which leads to terminal myoblast differentiation. Additionally, other important pathways that impact differentiation, namely Jak-Stat, RhoA-Erk and FAK were also analyzed. mRNA and protein expression levels of these factors and some of their targets were validated in vitro and in vivo. The data obtained, particularly in vitro, suggests that Lama2-deficiency leads to a defect in myoblast differentiation. This is supported by 1) a significant increase in the levels of Nfix and a decrease in Myog expression, encoding myogenin, as well as a deregulation of their downstream targets; 2) a significant retention of Myf5 protein in the cytoplasm; and 3) a significant increase in P-Stat3. The increase in P-Stat3 was also observed in LAMA2-deficient cancer cell lines, suggesting that an increase in P-Stat3 may be a key consequence of LAMA2 mutations, regardless of the type of disease. In summary, identifying the pathways and mechanisms deregulated in the absence of LAMA2 is essential for the development of therapies that target disease onset directly. | pt_PT |
| dc.identifier.tid | 203198999 | pt_PT |
| dc.identifier.uri | http://hdl.handle.net/10451/55503 | |
| dc.language.iso | eng | pt_PT |
| dc.relation | Centre for Ecology, Evolution and Environmental Changes | |
| dc.subject | LAMA2 | pt_PT |
| dc.subject | LAMA2-CMD | pt_PT |
| dc.subject | Matriz extracelular | pt_PT |
| dc.subject | Diferenciação | pt_PT |
| dc.subject | Nfix | pt_PT |
| dc.subject | Teses de mestrado - 2022 | pt_PT |
| dc.title | How Lama2-deficiency impacts myoblast differentiation in a mouse model for LAMA2-congenital muscular dystrophy | pt_PT |
| dc.type | master thesis | |
| dspace.entity.type | Publication | |
| oaire.awardNumber | PTDC/BTM-ORG/1383/2020 | |
| oaire.awardNumber | UIDB/00329/2020 | |
| oaire.awardTitle | Centre for Ecology, Evolution and Environmental Changes | |
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| oaire.fundingStream | 3599-PPCDT | |
| oaire.fundingStream | 6817 - DCRRNI ID | |
| project.funder.identifier | http://doi.org/10.13039/501100001871 | |
| project.funder.identifier | http://doi.org/10.13039/501100001871 | |
| project.funder.name | Fundação para a Ciência e a Tecnologia | |
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| rcaap.rights | openAccess | pt_PT |
| rcaap.type | masterThesis | pt_PT |
| relation.isProjectOfPublication | 93d2efab-f682-4e48-9364-5fc64ae4e0be | |
| relation.isProjectOfPublication | e6d2c5ff-9af2-4726-9821-7bcf881e9e2d | |
| relation.isProjectOfPublication.latestForDiscovery | 93d2efab-f682-4e48-9364-5fc64ae4e0be | |
| thesis.degree.name | Mestrado em Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento | pt_PT |