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Publicação
Backing up under pressure: role of sensory afferents in walking direction
| Nome: | Descrição: | Tamanho: | Formato: | |
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Orientador(es)
Resumo(s)
A capacidade de produzir movimento é importante para uma grande variedade de organismos, dos mais
simples aos mais complexos. De facto, é graças a movimentos como a locomoção que a maioria dos
organismos são capazes de procurar alimento ou fugir de predadores. A base por detrás deste controlo
de movimento é descrita como sendo bastante conservada entre organismos de complexidades bastante
distintas, como por exemplo entre vertebrados (como os mamíferos) e invertebrados (como os insetos).
Ambos os grupos apresentam um sistema nervoso central dividido em duas secções, o cérebro e a espinal
medula (ou cordão nervoso).
A Drosophila melanogaster, mais conhecida como mosca da fruta, é um modelo de invertebrado
extremamente utilizado graças à facilidade com que se obtêm grandes amostras em curto espaço de
tempo, possuindo ainda um conjunto de ferramentas genéticas bastante variado. Este é um modelo
bastante comum no estudo do movimento e da locomoção, por ser relativamente bem conhecida a rede
que está por detrás do controlo motor. A informação começa por partir de centros de ordem superior,
que a partir de neurónios descendentes chegam do cérebro ao cordão nervoso central (equivalente em
inseto à espinal medula). Aqui, a informação é transmitida através de interneurónios, que em conjunto
com os geradores de padrão centrais (responsáveis pela criação de sinais nervosos cíclicos e periódicos),
vão fazer chegar aos músculos, via neurónios motores, ordens para contrair ou distender. Contudo, o
sistema necessita de receber informação de volta, de modo a saber se o movimento está a ser produzido
de forma controlada, para providenciar a capacidade de obter controlo motor fino, assim como para
informar sobre estímulos que venham de fora do organismo. Para que esta informação volte para o
sistema, são necessárias estruturas de proprioceção associadas a neurónios sensoriais.
Na mosca da fruta, existem quatro estruturas sensoriais na pata que fazem parte do sistema
propriocetivo, sendo elas as Mechanosensory bristles (MB), as Hair plates (HP), o Chordotonal organ
(CO) e as Campaniform sensilla (CS). Cada uma destas estruturas está dedicada a informar o sistema
neuronal sobre um tipo específico de estímulos: as MB são a fonte de informação sobre estímulos táteis
na cutícula, dada a ausência de outros recetores neste exosqueleto rígido; as HP são responsáveis por
informar sobre a posição de segmentos adjacentes da pata; o CO providencia informação sobre o ângulo
da pata em cada momento; e por fim, as CS são sensores de carga, responsáveis por informar o corpo
sobre deformações no exoesqueleto causadas por pressão aplicada sobre o corpo da mosca, ou quando
a pata é pousada no solo. Todas estas estruturas já foram descritas e sua função estudada durante a
locomoção, com especial ênfase para o CO. Contudo, a informação sobre o papel destas estruturas como
iniciadores de movimento continuava por descrever.
Este foi o início de um projeto no laboratório Neurogenética da locomoção (CEDOC), do Dr. César
Mendes e aluna de doutoramento Alexandra Medeiros. Neste projeto, utilizando optogenética (técnica
que tem por base o uso de luz em certos comprimentos de onda para despolarizar neurónios específicos,
graças a canais iónicos sensíveis à luz) para estimular estas estruturas sensoriais, foi possível observar
que cada uma das estruturas produzia um padrão motor específico. Três das estruturas (MB, HP e CO)
produziam uma locomoção para a frente, com padrões de resposta distintos entre as três, contudo as CS
produziam um comportamento motor completamente diferente. Quando ativadas, estas estruturas
faziam com que a mosca andasse para trás, virasse para uma outra direção, e depois prosseguisse com
marcha à frente nessa outra direção. Foi também descrito que três das quatro estruturas (HP, CO e CS)
necessitavam de circuitos no cérebro para produzir o seu padrão motor, dado que quando decapitadas,
as moscas não reagiam ao estímulo luminoso. De modo a compreender melhor o que poderia produzir
este comportamento originário da ativação das campaniform sensilla, foi estudado o seu padrão de
expressão, que parecia demonstrar que as células marcadas nas patas projetavam cada uma para o respetivo neurópilo do cordão nervoso central. Contudo, mostrou também um conjunto de projeções
vindas das antenas, e que inervavam os lóbulos antenais. Com receio de que o comportamento fosse
originário destas projeções, foram testadas moscas que tinham as antenas amputadas, e que continuavam
a produzir o mesmo padrão motor.
O presente projeto tem assim como objetivos: I) descrever o comportamento motor produzido aquando
da ativação das campaniform sensilla, assim como investigar a função das antenas no mesmo; II) testar
o comportamento das moscas quando as CS são inativadas; III) criar um paradigma que possibilite o
teste destas estruturas sensoriais em moscas em movimento; IV) investigar os intermediários entre o
estímulo das campaniform sensilla e o padrão motor originado; V) e por fim, fazer um pequeno rastreio
de linhas que possam servir como novas ferramentas para o estudo das campaniform sensilla, utilizando
o sistema Split-Gal4.
Na primeira secção do estudo das campaniform sensilla, observámos que a estimulação das mesmas de
facto produz um padrão motor trifásico, composto por um momento de velocidade de valor negativo
(marcha à ré), seguido de um momento de elevada velocidade angular (consistente com a viragem), e
um momento de velocidade de valor positivo (marcha à frente, após a viragem). De seguida, tirando
partido dos dados obtidos anteriormente no laboratório para moscas com as antenas amputadas, e
utilizando um segundo grupo de moscas com o sistema de expressão alterado para restringir a expressão
à cabeça, mostramos como as moscas sem antenas produzem um comportamento similar ao
comportamento das moscas originais, e que a estimulação das projeções das antenas produz um padrão
motor distinto daquele previamente observado.
Na segunda secção do estudo, tentamos criar um novo paradigma que permite estimular as moscas
optogeneticamente, durante a sua locomoção, fazendo-as atravessar uma linha laser. Contudo, este
paradigma mostrou-se não eficaz para as linhas em estudo no projeto, e, portanto, foi abandonado.
Na terceira secção utilizámos um conjunto de túneis em que a altura diminui à medida que a mosca
avança, tentando criar novas pressões que ativem as campaniform sensilla. Utilizando moscas onde estas
estruturas foram geneticamente inativadas, observamos que apresentam uma tendência para avançar
mais do que moscas com as estruturas intactas, e eventualmente ficam presas no túnel. Mostramos
também, em túneis com altura constante ao longo do comprimento, que estas moscas não apresentam
problemas em recuar, pelo que o motivo pelo qual acabam presas aparenta de facto ser a sua
incapacidade em sentir o aumento da pressão sobre o corpo.
Na quarta secção do projeto produzimos uma linha recombinante que nos permite utilizar um segundo
sistema de expressão (LexA-LexAop) para inativar diferentes conjuntos de neurónios que foram
previamente descritos como importantes para comportamentos de recuo e de viragem, enquanto ao
mesmo tempo ativamos as campaniform sensilla com o sistema original (Gal4-UAS). Contudo, devido
a constrições temporais, apenas fomos capazes de testar um controlo negativo para o sistema LexALexAop, que demonstrou que o recombinante tem um comportamento semelhante à linha original.
Por fim, na última secção do estudo tirámos partido do sistema Split-Gal4, que transforma o clássico
sistema binário Gal4-UAS em um sistema de três partes, dividindo a proteína GAL4 em duas
subunidades (AD – Activation domain – e DBD – DNA binding domain). Ao cruzar cinco linhas AD
com quatro linhas DBD, para um total de 20 combinações possíveis, conseguimos identificar 13 linhas
que marcam as CS nas patas da mosca, e uma linha que marca CS e CO. As restantes seis linhas não
apresentavam expressão, ou apresentavam um padrão de expressão aberrante.
Com este trabalho procuramos providenciar mais informação sobre o funcionamento das estruturas
sensoriais que são as campaniform sensilla, assim como dar novas técnicas para o seu estudo. Tendo em conta o quão conservado o controlo motor é entre organismos de diferentes complexidades, acreditamos
que uma melhor compreensão do funcionamento das CS pode vir a dar novo conhecimento em
organismos como os mamíferos, podendo até originar novos métodos de análise e tratamento de
patologias que originem deficiências nos sistemas de proprioceção e controlo motor.
Movement is an important part of the life of most organisms. Whether it is to find sustenance or flee from danger, animals need to produce movement. The system behind motor control is conserved amongst a large variety of animals. In the current study, we utilise Drosophila melanogaster as a model for locomotor behaviour, a particular form of movement. The fruit fly can control its movement thanks to a set of neural circuits distributed along the central nervous system, composed by the brain and the ventral nerve cord. To produce a motion, information coming from higher order centres in the brain through descending neurons gets to the ventral nerve cord, where interneurons will interact with the output from central pattern generators (source of rhythmic signals), to induce muscle contractions via the motor neurons. To adjust this movement and provide a fine motor control, there is the need for proprioceptors, structures attached to sensory neurons that inform the circuit on how a movement is being produced. In the legs of the fly, there are four mechanosensory proprioceptors, each with a specific function: the Mechanosensory bristles, the Hair plates, the Chordotonal organ and the Campaniform sensilla. Previous work has shown that optogenetic activation of each proprioceptor in immobile flies induces a specific motor output. Leg campaniform sensilla (load-sensors that inform of cuticle deformation, such as during the stance phase of locomotion), upon activation, produce a movement composed by three phases: backward walking, followed by turning and forward walking. Contrasting, the chordotonal organ (structure that encodes the angle of the joints) induces forward walking. It has also been described that decapitated flies do not present these behaviours, meaning that the central brain is necessary to produce them. So, the objectives of this project were to further characterize the behaviour produced upon optogenetic activation of leg campaniform sensilla in immobile and in motion flies, in comparison with the chordotonal organ induced behaviour. We also intended to describe the behaviour of flies with inactive leg campaniform sensilla. And lastly, we wanted to produce new tools to study this mechanosensory structure, starting with a system to identify intermediates between sensory input and motor output, as well as searching combinations of Split-Gal4 lines that drive the expression in leg campaniform sensilla. We started by confirming that the activation of the leg campaniform sensilla induced a three phased behaviour, starting with a peak of negative velocity (backward walking). This is followed by a change in velocity sign, and accompanied by a peak in angular velocity, correspondent to the turning behaviour that precedes the forward motion phase. We also found that inactivation of the leg campaniform sensilla inside a narrowing tunnel caused flies to get stuck, not sensing the load increase from the decreasing height. Lastly, we created two new tools to study the leg campaniform sensilla, by creating a recombinant that allows to use two expression systems for activation of campaniform sensilla and inactivation of other structures that might be a part of the neural circuit responsible for this behaviour. We also performed a small screen of Split-Gal4 lines that drive expression in the leg campaniform sensilla ending with 13 possible combinations. With this work, we hope to provide new insight into the working of these mechanosensory structures, hoping this information can someday be useful for the comprehension of similar systems in other organisms such as humans.
Movement is an important part of the life of most organisms. Whether it is to find sustenance or flee from danger, animals need to produce movement. The system behind motor control is conserved amongst a large variety of animals. In the current study, we utilise Drosophila melanogaster as a model for locomotor behaviour, a particular form of movement. The fruit fly can control its movement thanks to a set of neural circuits distributed along the central nervous system, composed by the brain and the ventral nerve cord. To produce a motion, information coming from higher order centres in the brain through descending neurons gets to the ventral nerve cord, where interneurons will interact with the output from central pattern generators (source of rhythmic signals), to induce muscle contractions via the motor neurons. To adjust this movement and provide a fine motor control, there is the need for proprioceptors, structures attached to sensory neurons that inform the circuit on how a movement is being produced. In the legs of the fly, there are four mechanosensory proprioceptors, each with a specific function: the Mechanosensory bristles, the Hair plates, the Chordotonal organ and the Campaniform sensilla. Previous work has shown that optogenetic activation of each proprioceptor in immobile flies induces a specific motor output. Leg campaniform sensilla (load-sensors that inform of cuticle deformation, such as during the stance phase of locomotion), upon activation, produce a movement composed by three phases: backward walking, followed by turning and forward walking. Contrasting, the chordotonal organ (structure that encodes the angle of the joints) induces forward walking. It has also been described that decapitated flies do not present these behaviours, meaning that the central brain is necessary to produce them. So, the objectives of this project were to further characterize the behaviour produced upon optogenetic activation of leg campaniform sensilla in immobile and in motion flies, in comparison with the chordotonal organ induced behaviour. We also intended to describe the behaviour of flies with inactive leg campaniform sensilla. And lastly, we wanted to produce new tools to study this mechanosensory structure, starting with a system to identify intermediates between sensory input and motor output, as well as searching combinations of Split-Gal4 lines that drive the expression in leg campaniform sensilla. We started by confirming that the activation of the leg campaniform sensilla induced a three phased behaviour, starting with a peak of negative velocity (backward walking). This is followed by a change in velocity sign, and accompanied by a peak in angular velocity, correspondent to the turning behaviour that precedes the forward motion phase. We also found that inactivation of the leg campaniform sensilla inside a narrowing tunnel caused flies to get stuck, not sensing the load increase from the decreasing height. Lastly, we created two new tools to study the leg campaniform sensilla, by creating a recombinant that allows to use two expression systems for activation of campaniform sensilla and inactivation of other structures that might be a part of the neural circuit responsible for this behaviour. We also performed a small screen of Split-Gal4 lines that drive expression in the leg campaniform sensilla ending with 13 possible combinations. With this work, we hope to provide new insight into the working of these mechanosensory structures, hoping this information can someday be useful for the comprehension of similar systems in other organisms such as humans.
Descrição
Tese de Mestrado em Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento, Faculdade de Ciências, Universidade de Lisboa, 2022
Palavras-chave
Drosophila Proprioceção Sensila campaniforme Optogenética Teses de mestrado - 2022