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Targeting the c-MYC G4 - DHX36 helicase interaction with indoloisoquinoline derivatives
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Orientador(es)
Resumo(s)
O cancro é uma doença multifatorial caracterizada pelo crescimento celular descontrolado resultante de mutações genéticas, que podem invadir tecidos tanto próximos como distantes num processo denominado de metástase. Atualmente persiste como um desafio complexo e desafiante na investigação científica. Existem já diversos tratamentos para o cancro, como a radioterpapia, cirugia e quimioterapia. Porém, muitas vezes estes tratamentos confrontam-se com a adaptabilidade e resistência das células cancerígenas, impelindo os investigadores a explorar abordagens inovadoras devido ao escasso número de soluções de tratamento eficazes. A medicina de precisão e as terapias direcionadas emergem como estratégias promissoras, visando cuidadosamente as vulnerabilidades intrínsecas às células malignas, enquanto preservam os tecidos e células saudáveis. Neste panorama dinâmico, os G-quadruplexos (G4s) emergem como protagonistas, oferecendo uma nova perspetiva para o desenvolvimento de terapias anti-cancro
mais eficazes.
Atualmente, o gene c-MYC tem sido uma figura proeminente neste contexto. O c-MYC é um proto-oncogene que codifica para um fator de transcrição, sendo frequentemente sob expresso em vários tipos de cancro. Este gene regula processos celulares críticos, incluindo proliferação celular, apoptose e metabolismo. Tendo em conta o seu envolvimento direto em
processos celulares de extrema relevância, a desregulação do c-MYC é um denominador comum em muitos tipos de cancro, tornando-o um alvo atrativo para intervenções terapêuticas. A transcrição do c-MYC pode ser regulada através de diversos mecanismos e proteínas, inclusive por estruturas como o G-quadruplexo (G4), localizadas na região promotora deste gene.
Os G4s, estruturas moleculares distintivas presentes em sequências de ADN ou ARN, exibem arranjos empilhados de bases de guanina que exercem uma influência determinante na expressão génica, especialmente em genes associados ao cancro. A atratividade das terapêuticas direcionadas a G4 reside na capacidade de realizar intervenções precisas, minimizando danos colaterais e atenuando os efeitos secundários severos, frequentemente vinculados às terapias
tradicionais como a quimioterapia e radioterapia convencionais. Apesar de estruturas dinâmicas, a estabilidade inerente e a resistência à mutação das estruturas de G4 posicionamnas como alvos robustos para terapêuticas inovadoras contra o cancro. Desta forma, estas estruturas são atualmente alvo de investigação como alvos terapêuticos tendo em vista o objetivo de regular negativamente a transcrição de oncogenes, como o c-MYC. De forma adicional e complementar, a intervenção estratégica da helicase DHX36, responsável pelo desenrolar específico de estruturas de G4 e fundamental em processos de transcrição e replicação, amplia o potencial das terapêuticas direcionadas a G4, influenciando genes cruciais na progressão do cancro. O direcionamento estratégico à DHX36 no contexto dos G4s emerge como uma
perspetiva promissora, introduzindo possibilidades terapêuticas inovadoras, promovendo a perturbação
de processos fundamentais cruciais para a sobrevivência das células cancerígenas. A relevância de visar a interação DHX36:G4 reside na sua capacidade de desmantelar a maquinaria molecular impulsionadora da progressão do cancro. Ao visar com precisão esta interação, as intervenções terapêuticas podem ser personalizadas para perturbar os mecanismos de sobrevivência das células cancerígenas. Este nível de precisão contrasta significativamente com as
terapêuticas tradicionais, frequentemente associadas a danos generalizados nos tecidos saudáveis e a efeitos secundários. A disrupção estratégica da interação DHX36:G4 surge, portanto, como uma via promissora para o desenvolvimento de terapêuticas contra o cancro mais seletivas e menos tóxicas. Atualmente, diversas pequenas moléculas capazes de se ligar a estruturas de G4 estão a ser estudadas tendo em vista melhorar a sua seletividade para o G4 em relação a outras estruturas secundárias como a dupla hélice de ADN. Tendo isto em conta, a premissa
central da nossa pesquisa foca-se em torno de uma abordagem inovadora: atingir de forma simultânea o c-MYC G4 e a sua interação com o seu regulador negativo, a helicase DHX36, através do desenho de ligandos de G4. Esta estratégia inovadora não procura apenas retardar, mas também interromper as interações moleculares essenciais à progressão do cancro de forma a conseguir um aumento de seletividade, sem comprometer a eficácia da estabilização do G4
utilizando pequenas moléculas. Para atingir este objetivo, estudos computacionais, compreendendo técnicas de Dinâmica Molecular e Docking Molecular complementares com estudos sintéticos desempenham um papel crucial numa abordagem multidisciplinar.
Inicialmente, começámos por avaliar a estabilidade estrutural de quatro estruturas de c-MYC G4 distintas (a nível de arranjo estrutural e iónico) através da Dinâmica Molecular, revelando padrões consistentes de estabilidade. Posteriormente, a nossa pesquisa aprofundou-se nas interações entre essas estruturas de G4 e os compostos derivados de Indoloisoquinolina (IDIQ) 11-mono e 5,11-di-substituídos selecionados, usando uma combinação de estudos de Docking Molecular e simulações de Dinâmica Molecular. Esta abordagem revelou locais de ligação preferenciais
predominantemente nos sulcos do G4 e nos G-quartetos terminais em 5’ e 3’. Além disso, conseguimos corroborar também o anteriormente descrito na literatura, observando que o core da IDIQ interage com as guaninas do G4 através de ligações π-π stacking e as cadeias laterais podem também interagir com as guaninas através de ligações π-π stacking ou com as cadeias de fosfato do G4, através de interações eletrostáticas. Notavelmente, os compostos di-substituídos, particularmente aqueles com cadeias laterais contendo o anel de piridina, exibiram afinidades de ligação robustas. Surpreendentemente, as diferenças de estabilidade reveladas pela Dinâmica Molecular entre as estruturas de G4 em complexo com compostos monoe di-substituídos, foram menos pronunciadas do que o esperado. Em relação às interações dos derivados de IDIQs com o complexo G4:DHX36, este estudo revelou locais de ligação distintos
com implicações multifacetadas. Essas interações potencialmente influenciam os processos de reconhecimento e desenrolar do G4 pela helicase DHX36, induzindo alterações estruturais tanto na helicase como no G4. Após a obtenção dos resultados computacionais, e com base neles, a nossa investigação concentrou-se na síntese dos compostos IDIQ di-substituídos. O composto de partida (8-cloro-11H-indolo[3,2-c]isoquinolina-5-amina 3) foi obtido com bons rendimentos (19-49%) através de uma ciclização por tandem catalisada por base (NaH) numa reação ’one-pot-two-step’, e a partir dele explorámos as diferentes condições (solvente, equivalentes de eletrófilo e bases) para obter os compostos alvo N5,N11 di-substituídos através de reações SN2 com o 2-bromometil-piridina.
Com base em estudos anteriores feitos no nosso laboratório, de forma a obter os derivados 11-mono substituídos, conduzimos estudos em pequena escala, variando o catalisador base, o solvente e os equivalentes de eletrófilo (2-bromometil-piridina). A análise das misturas de reação obtidas por HPLC-DAD-MS revelou que o grupo 5-NH2 é um nucleófilo muito fraco.
Assim, decidimos seguir uma via alternativa, na qual a posição 5 seria o eletrófilo (5-Cl). A nossa estratégia inicial para converter o grupo 5-amino no grupo 5-oxo formou o sal de diazónio e em meio ácido foi convertido o grupo –NH2 em -H, no entanto ficou estagnado nesse passo. Explorámos então uma abordagem alternativa na qual sintetizaríamos o núcleo 8-cloro-6,11-dihidro-5H-indolo[3,2-c]isoquinolina-5-ona a partir da reação de dupla ciclização entre o (4-cloro-2-cianofenil)carbamato e o 2(bromometil)benzoato de metil na presença de uma base forte. Infelizmente, essa abordagem estagnou na fase intermédia da reação. Assim, observamos que a síntese destes compostos é bastante desafiadora, necessitando de um estudo mais detalhado da nucleofilia e reatividade do core dos compostos de indoloisoquinolina. Para além disto, a procura de vias alternativas será sempre necessária para obter com sucesso o
composto 5,11-di-substítuido.
Concluindo, este projeto explorou uma série de metodologias multidisciplinares e complementares para explorar as interações IDIQ:G4, estabilidade e interações IDIQ:G4:helicase, como uma potencial nova abordagem com aplicações na terapia do cancro. De forma geral, os objetivos específicos propostos para este trabalho foram alcançados, isto é, foi possível estabelecer relações de estrutura-atividade dos compostos IDIQ selecionados com o c-MYC G4 e
em complexo com a helicase DHX36 e foi possível abordar novas alternativas sintéticas tendo em vista a síntese de compostos di-substítuidos. Neste contexto, os estudos realizados até ao momento são, sem dúvida, pontos de partida para trabalhos futuros que continuarão com o objetivo de obter dados de atividade biológica, cujos resultados serão utilizados no futuro para projetar derivados de novos ligandos de G4 com maior atividade e seletividade.
Cancer, marked by uncontrolled cell growth due to genetic mutations, presents a significant therapeutic challenge due to the adaptability and resistance of cancer cells to conventional treatments. To address these challenges, innovative approaches, such as a targeted approach to G-quadruplexes (G4s), have emerged. G4s, unique molecular structures in DNA, play a crucial role in downregulating gene expression, especially in cancer-related genes such as c-MYC. The inherent stability and resistance to mutation in promotor regions of G4 structures make them promising targets for innovative cancer therapies. Our research centers on DHX36 helicase, which interacts with G4 structures in the genome, influencing genes linked to cancer progression. Targeting DHX36 within the G4 context opens avenues for precise cancer therapy, disrupting essential processes for cancer cell survival. Our innovative approach simultaneously targets c-MYC G4 and its interaction with its negative regulator DHX36 helicase through G4-ligand design. Beginning with a family of 5-amino-8-chloro-11-H-indolo[3,2-c]isoquinoline (IDIQ) derivatives as promising scaffolds, our research employs a multidisciplinary approach. Structural analyses via Molecular Dynamics revealed consistent stability among c-MYC G4 structures. Exploring their interactions with 11-mono and 5,11-di-substituted IDIQ compounds, employing Molecular Docking and Dynamics simulations, pinpointed preferential binding sites within G4 grooves and the 5’ and 3’ terminal quartets. Di-substituted compounds, particularly those with pyridine ring-containing side chains, demonstrated robust binding affinities. Investigations of IDIQ derivatives with the G4:DHX36 complex unveiled distinctive binding locations, potentially reshaping G4 recognition and unwinding processes. Synthesizing di-substituted IDIQ compounds posed challenges, requiring a nuanced study of nucleophilicity and reactivity. Attempts to convert the 5-amino group into an oxo group through diazonium salt formation stalled in the intermediate reaction. An alternative strategy, synthesizing the 8-chloro-6,11-dihydro-5-H-indolo[3,2-c]isoquinolini 5-one core, also encountered obstacles and halted at the intermediate stage. In conclusion, our project explored IDIQ:G4 interactions and stability, focusing on IDIQ:G4:helicase interactions. Serving as catalysts for future endeavors, these explorations strive to uncover potential applications in cancer therapy, with subsequent research aimed at acquiring biological activity data to craft derivatives of new G4-ligands with heightened efficacy and selectivity.
Cancer, marked by uncontrolled cell growth due to genetic mutations, presents a significant therapeutic challenge due to the adaptability and resistance of cancer cells to conventional treatments. To address these challenges, innovative approaches, such as a targeted approach to G-quadruplexes (G4s), have emerged. G4s, unique molecular structures in DNA, play a crucial role in downregulating gene expression, especially in cancer-related genes such as c-MYC. The inherent stability and resistance to mutation in promotor regions of G4 structures make them promising targets for innovative cancer therapies. Our research centers on DHX36 helicase, which interacts with G4 structures in the genome, influencing genes linked to cancer progression. Targeting DHX36 within the G4 context opens avenues for precise cancer therapy, disrupting essential processes for cancer cell survival. Our innovative approach simultaneously targets c-MYC G4 and its interaction with its negative regulator DHX36 helicase through G4-ligand design. Beginning with a family of 5-amino-8-chloro-11-H-indolo[3,2-c]isoquinoline (IDIQ) derivatives as promising scaffolds, our research employs a multidisciplinary approach. Structural analyses via Molecular Dynamics revealed consistent stability among c-MYC G4 structures. Exploring their interactions with 11-mono and 5,11-di-substituted IDIQ compounds, employing Molecular Docking and Dynamics simulations, pinpointed preferential binding sites within G4 grooves and the 5’ and 3’ terminal quartets. Di-substituted compounds, particularly those with pyridine ring-containing side chains, demonstrated robust binding affinities. Investigations of IDIQ derivatives with the G4:DHX36 complex unveiled distinctive binding locations, potentially reshaping G4 recognition and unwinding processes. Synthesizing di-substituted IDIQ compounds posed challenges, requiring a nuanced study of nucleophilicity and reactivity. Attempts to convert the 5-amino group into an oxo group through diazonium salt formation stalled in the intermediate reaction. An alternative strategy, synthesizing the 8-chloro-6,11-dihydro-5-H-indolo[3,2-c]isoquinolini 5-one core, also encountered obstacles and halted at the intermediate stage. In conclusion, our project explored IDIQ:G4 interactions and stability, focusing on IDIQ:G4:helicase interactions. Serving as catalysts for future endeavors, these explorations strive to uncover potential applications in cancer therapy, with subsequent research aimed at acquiring biological activity data to craft derivatives of new G4-ligands with heightened efficacy and selectivity.
Descrição
Tese de mestrado, Química Medicinal e Biofarmacêutica, 2023, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia.
Palavras-chave
G-quadruplex c-MYC DHX36 Indoloisoquinolines Molecular dynamics Teses de mestrado - 2023