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Publicação
Gordonia alkanivorans strain 1B biorefinery towards green fuels and high added-value bioproducts production
| Nome: | Descrição: | Tamanho: | Formato: | |
|---|---|---|---|---|
| 1.62 MB | Adobe PDF |
Orientador(es)
Resumo(s)
Os combustíveis fósseis abriram novas portas para a humanidade ao permitir o uso de mais energia,
primeiro do carvão, seguido do petróleo e gás natural. A queima de combustíveis fósseis é o maior
contribuinte para a poluição atmosférica e uma preocupação para a saúde pública (Candelone et al.,
2021), devido à emissão de dióxido de enxofre, partículas finas de sulfatos metálicos, entre outros.
De modo a controlar a emissão destas substâncias, diversos países têm imposto limites para a quantidade
de enxofre presente nos combustíveis fosseis e combustíveis de nova geração. Várias técnicas têm sido
então desenvolvidas para remover o enxofre destes combustíveis, sendo a hidrodessulfurização (HDS),
a mais utilizada pela indústria petrolífera. Tendo esta vários problemas, são necessárias alternativas,
sendo uma delas a biodessulfurização (BDS) (Mohebali & Ball, 2008a). A BDS pode ser uma opção ou
uma tecnologia suplementar para dessulfurizar os combustíveis fósseis, através do uso de
microrganismos com capacidade de desulfurização. No entanto, para aplicar a BDS à escala industrial
ainda é necessário ultrapassar alguns obstáculos.
Este trabalho centra-se então na bactéria Gordonia alkanivorans estirpe 1B que foi isolada de amostras
de solo contaminadas com petróleo, nos terrenos atualmente pertencentes ao Parque das Nações (Lisboa,
Portugal).
Nos últimos anos, vários trabalhos demonstraram o potencial da bactéria G. alkanivorans estirpe 1B
para a biodessulfurização de combustíveis (Alves et al., 2015; Alves & Paixão, 2011), através da via 4S
(Alves et al., 2007).
Para reduzir os custos de produção de biocatalizadores, um dos problemas da BDS, torna-se importante
procurar fontes de carbono alternativas, baratas e sustentáveis como os resíduos agroindustriais (Alves
& Paixão, 2014b; Paixão et al., 2020). Neste contexto, tendo em conta a natureza frutofílica desta
bactéria, foram exploradas fontes de carbono agroindustriais ricas em frutose (ex: medronho,
tupinambo) (Silva, 2012; Silva et al., 2013, 2015; Alves & Paixão, 2014a, 2014b; Pacheco et al., 2019).
Um dos principais objetivos deste trabalho foi então a valorização de um resíduo (STFr), de fabricantes
de compota de medronho, como fonte de carbono alternativa para o cultivo de G. alkanivorans estirpe
1B.
O primeiro passo do trabalho foi produzir licores ricos em açúcares (fru/glu) a partir de resíduos de
medronho (STFr liquor). O primeiro lote de medronho (lote #1) resultou num licor rico em açúcares,
contendo 110 g/L de açúcares totais e 3,72 g/L de compostos fenólicos. Mais dois lotes de licor foram
também produzidos (lote #2: 107 g/L de açúcares totais e 3,15 g/L de fenólicos; lote #3: 66 g/L de
açúcares totais e 4,12 g/L de fenólicos).
Com o primeiro licor (STFr liquor - lote #1), foi realizado um ensaio preliminar para avaliar o potencial
para crescimento e a atividade de dessulfurização da G. alkanivorans estirpe 1B, em frasco agitado, com
14 g/L açúcares totais (fru/glu). Utilizando este licor como fonte de carbono e sulfatos, houve um
pequeno crescimento, indicativo de uma concentração inicial de enxofre.
No geral, esses resultados indicam que alguns nutrientes, como o enxofre, foram limitantes, permitindo
apenas alguma formação de biomassa no início. Portanto, às 125 h de crescimento, 300 µM de DBT
foram adicionados ao meio de cultura. Nestas condições, por volta das 149 h, a estirpe 1B foi capaz de
crescer, consumir os açúcares e produzir biomassa, atingindo uma taxa máxima de crescimento (µmax)
de 0.091 h-1
.
Uma vez que mesmo após a adição de DBT existiu uma fase latência de perto de 24 h, foi realizado um
ensaio de destoxificação do licor para mitigar o efeito inibitório deste licor no crescimento da estirpe
1B. Diferentes concentrações de carvão ativado foram testadas (1 a 4% CA), de modo a selecionar a
quantidade mínima necessária à destoxificação. Estes 4 licores foram então testados como fonte de carbono, para cultivar a estirpe 1B em frasco agitado.
Nestas condições, a estirpe 1B, foi capaz de crescer, consumir todos os açúcares e DBT. Diminuindo a
fase de latência para 15 h para 1% CA e 10 h para ≥2% CA. A fase exponencial foi mantida até às 69 h
para todas as condições, atingindo uma DO máxima de 13,5 para o licor tratado com 4% CA. Da mesma
forma, as taxas máximas de crescimento (µmax) também aumentaram com o aumento da % CA, atingindo
um µmax de 0,119 h-1
; bem como as taxas de consumo de açúcares totais, com 0,175 g/L/h para 4% de
CA.
Referente à biodessulfurização, o 2-HBP foi detetado primeiro nos licores resultantes dos tratamentos
com mais CA (3 e 4%), obtendo também os valores mais elevados de máximo 2-HBP produzido (8.83
- 8.88 µM/h, 4 e 3% CA respetivamente). Comparando os diferentes parâmetros metabólicos para os 4
licores destoxificados, o melhor tratamento parece ser a destoxificação com 4% de CA.
O próximo passo foi realizar ensaios de biodessulfurização, de modo a comparar a utilização do licor
não tratado (STFr liquor) e do licor tratado com 4% CA (Detox STFr liquor) com a utilização de
açúcares comerciais (glu+fru) para crescimento da estirpe 1B em frasco agitado, partindo de uma
concentração de açúcares de 9 g/L e 300 µM de DBT como fonte de enxofre.
Relativamente aos resultados de biodessulfurização, o 2-HBP foi detetado primeiro tanto na cultura com
o licor destoxificado como na cultura com açúcares comerciais. Ao utilizar açúcares comerciais foi
possível obter o máximo de concentração de 2-HBP, assim como a taxa de produção mais alta (305 µM
e 11.611 µM/h, respetivamente). No entanto, a taxa específica máxima de dessulfurização, q2-HBP, foi
obtida com o licor tratado (5.72 µmol/g(peso seco)/h).
A informação obtida nos diferentes ensaios em frasco agitado permitiu otimizar as condições de cultura
para usar o licor do resíduo de medronho (STFr liquor/ Detox STFr liquor) como fonte de carbono numa
cultura contínua, realizando vários ensaios em quimiostato.
Num primeiro ensaio em quimiostato, utilizando um licor de resíduo de medronho (STFr liquor – lote
#3) como fonte carbono, contendo 5,4 g/L de açúcares redutores, realizado a uma taxa de diluição de
0,04 h-1
(cultura STFr L1), obteve-se um consumo completo de açúcar, produzindo células com
capacidade de dessulfurização (4,32 µmol(2-HBP)/g(peso seco)/h). Aumentando a taxa de diluição para 0,05
h
-1
(cultura STFr L2), com o mesmo licor (5,4 g/L de açúcares redutores), deu-se uma redução na
atividade de biodessulfurização para 1,843 µmol(2-HBP)/g(peso seco)/h. Por esta razão, a cultura com o licor
após tratamento com 4% CA (4,72 g/L açúcares redutores) foi realizada com uma taxa de diluição de
0,04 h-1 (cultura DTX STFr L).
Nos ensaios de BDS com resting cells a maior produção de 2-HBP foi alcançada com células do estado
estacionário STFr L1, atingindo 212,68 µM, com uma taxa específica (q2-HBP) de 6.499 µmol/g(peso seco)/h.
Estes ensaios mostram que é possível usar um resíduo agroindustrial para produzir células saudáveis
que podem dessulfurizar.
De modo a viabilizar economicamente todo este processo é necessário aproveitar produtos secundários
que a célula possa produzir. Neste caso são produzidos pigmentos e surfactantes que podem ser
aproveitados após a dessulfurização e beneficiar o processo tornando-o mais economicamente viável.
Relativamente à quantificação dos carotenoides produzidos pela estirpe 1B, primeiro foram realizados
testes combinando os solventes tradicionalmente usados (ex: acetato de etilo) com líquidos iónicos (LIs)
(Silva et al., 2016; Fernandes et al., 2018).
Neste contexto, para avaliar o potencial dos LIs na eficiência da extração de carotenoides da estirpe 1B,
foi realizado um grupo de ensaios para testar 19 LIs combinados com acetato de etilo (AcE, solvente
conhecido pela sua elevada capacidade de extração). Dos 19 LIs testados, apenas 10 foram capazes de
formar um sistema bifásico e extrair os carotenoides. Com base no valor de carotenoides totais obtidos,
selecionaram-se os dois LIs que originaram as maiores extrações. Testes posteriores confirmaram a maior eficiência do LI #18 como co-solvente para extrair carotenoides e, procedeu-se à otimização do
método de extração usando LI #18/ AcE com recurso a dois desenhos experimentais sequencias (#ED1
e #ED2), baseados na distribuição de Doehlert (Doehlert, 1970) para dois factores (X1 = volume IL#18
volume; X2 = volume Ac. etilo).
Utilizando este novo método de extração otimizado (50 µL de IL#18 + 1125 µL de AcE), avaliou-se a
produção de carotenoides totais na biomassa produzida nas culturas em quimiostato (EEs: STFr L1,
DTX STFr L e mistura fru/glu), acima referidas. Na cultura com o STFr liquor (EE STFr L1), como
fonte carbono alternativa, a estipe 1B produziu 338 μgCarotenoides/g(peso seco); na cultura com o detox STFr
liquor (EE DTX STFr L) produziu 106 μgCarotenoides/g(peso seco) e na cultura com os açúcares comerciais
(fru/glu) produziu 125 μgCarotenoides/g(peso seco). Estes são resultados promissores para a obtenção de
pigmentos microbianos para aplicação na indústria agro-alimentar.
Para além da produção de carotenoides, também foi avaliada a produção de BS/BE nas diferentes
culturas em quimiostato. As atividades de emulsificação mais elevadas foram conseguidas nos EEs:
STFr L1 (EA = 8 U/mL) e DTX STFr L (EA = 7,69 U/mL), partindo de 5 g/L de fonte de carbono
inicial.
Em geral, os resultados obtidos neste trabalho demonstraram o potencial da utilização de licor de resíduo
de medronho (STFr liquor) como fonte de carbono alternativa para o processo de dessulfurização do
DBT pela estirpe 1B. No entanto, mais estudos de otimização/aumento de escala são necessários para
avaliar a sua aplicabilidade técnico-económica para a dessulfurização de combustíveis fósseis/óleos de
pirólise.
In biodesulfurization (BDS) microorganisms are used to remove sulfur from fuels. Compared to conventional thermochemical treatments, it is cleaner and more efficient. However, since microorganisms have lower reaction rates, greater amounts of biocatalyst are needed, increasing overall costs. To overcome this, several approaches have been pursued, such as experimenting with alternative carbon sources from sustainable streams or exploring the valorization of high added value products produced by the microorganisms. This work aims to access the potential of the strawberry tree fruit residue (STFr) as an alternative carbon source for a BDS biorefinery. In this context, a series of assays, first in shake-flask and then in chemostat, were carried out to develop and optimize the STFr liquor as a viable carbon source. Hence, a sugar rich liquor (60% fructose/ 40% glucose) was produced from the STFr, resulting in an inhibitory lag phase in the skake-flask. A detoxification process was performed with 1, 2, 3 and 4% (w/v) of activated charcoal (AC) to eliminate this problem. With all percentages of AC, the lag phase was successfully eliminated, and the best result were achieved when using 4% AC, with the highest growth (OD600nm = 13.5); the highest growth rate (µmax = 0.119 h-1 ); highest sugars consumption rate (0.175 g/L/h); and highest 2-HPB production (347 µM). So, this treatment was chosen to a new set of assays to compare the kinetics of the cultures when using detoxified STFr liquor with commercial sugars, and non-detoxified STFr liquor. In overall, the best resuls of growth and BDS were obtained for the detoxified liquor (DTX STFr liquor). These carbon sources were further tested and optimized in chemostat assays (1L bioreactor) to obtain steady state (SS) cultures (STRr L1 - 0.04 h-1 of dilution rate, STRr L2 - 0.05 h-1 of dilution rate, DTX STFr L - 0.04 h-1 of dilution rate, Fru+Glu - 0.04 h -1 of dilution rate). The highest biomass was achieved in STFr L2 culture (2.79 g/L), using STFr liquor, and the lowest was achieved in Fru+Glu culture (1.89 g/L), using the mixture of commercial sugars. Using the STFr liquor as carbon source, even with sulfur free mineral minimized (SFMM) culture medium, there was enough nutrients to generate more biomass than when using commercial sugars with a non-minimized culture medium (SFM), possibly due to be a complex C-source with some additional nutrients. The cells produced in bioreactor resulted in biocatalysts with desulfurization ability, being obtained the higher values of specific rate of 2- hydroxibyphenil production (q2-HPB) for cells from the SS cultures STFr L1 (6.50 µmol/g(DCW)/h) and DTX STFR L (6.98 µmol/g(DCW)/h). However, in overall, the results from chemostat assays point out for the use of untreated STFr liquor as the best carbon source. This demonstrates that is possible to use an agroindustrial residue as a sustainable alternative C-source to produce cost-effective biocatalysts with high desulfurization ability. Moreover, strain 1B is able of produce carotenoids and biosurfactants/bioemulsifiers (BS/BE) and cells from the STFr L1 were those that presented the highest production of carotenoids (338±15 g/gDCW) and BS/BE (Emulsifying activity: 8 U/mL). Both carotenoids and BS/BE results open prospects for further bioproducts valorization contributing for the global economic viability of a BDS process considering G. alkanivorans strain 1B biorefinery as an integrative process aiming to get BDS scale-up.
In biodesulfurization (BDS) microorganisms are used to remove sulfur from fuels. Compared to conventional thermochemical treatments, it is cleaner and more efficient. However, since microorganisms have lower reaction rates, greater amounts of biocatalyst are needed, increasing overall costs. To overcome this, several approaches have been pursued, such as experimenting with alternative carbon sources from sustainable streams or exploring the valorization of high added value products produced by the microorganisms. This work aims to access the potential of the strawberry tree fruit residue (STFr) as an alternative carbon source for a BDS biorefinery. In this context, a series of assays, first in shake-flask and then in chemostat, were carried out to develop and optimize the STFr liquor as a viable carbon source. Hence, a sugar rich liquor (60% fructose/ 40% glucose) was produced from the STFr, resulting in an inhibitory lag phase in the skake-flask. A detoxification process was performed with 1, 2, 3 and 4% (w/v) of activated charcoal (AC) to eliminate this problem. With all percentages of AC, the lag phase was successfully eliminated, and the best result were achieved when using 4% AC, with the highest growth (OD600nm = 13.5); the highest growth rate (µmax = 0.119 h-1 ); highest sugars consumption rate (0.175 g/L/h); and highest 2-HPB production (347 µM). So, this treatment was chosen to a new set of assays to compare the kinetics of the cultures when using detoxified STFr liquor with commercial sugars, and non-detoxified STFr liquor. In overall, the best resuls of growth and BDS were obtained for the detoxified liquor (DTX STFr liquor). These carbon sources were further tested and optimized in chemostat assays (1L bioreactor) to obtain steady state (SS) cultures (STRr L1 - 0.04 h-1 of dilution rate, STRr L2 - 0.05 h-1 of dilution rate, DTX STFr L - 0.04 h-1 of dilution rate, Fru+Glu - 0.04 h -1 of dilution rate). The highest biomass was achieved in STFr L2 culture (2.79 g/L), using STFr liquor, and the lowest was achieved in Fru+Glu culture (1.89 g/L), using the mixture of commercial sugars. Using the STFr liquor as carbon source, even with sulfur free mineral minimized (SFMM) culture medium, there was enough nutrients to generate more biomass than when using commercial sugars with a non-minimized culture medium (SFM), possibly due to be a complex C-source with some additional nutrients. The cells produced in bioreactor resulted in biocatalysts with desulfurization ability, being obtained the higher values of specific rate of 2- hydroxibyphenil production (q2-HPB) for cells from the SS cultures STFr L1 (6.50 µmol/g(DCW)/h) and DTX STFR L (6.98 µmol/g(DCW)/h). However, in overall, the results from chemostat assays point out for the use of untreated STFr liquor as the best carbon source. This demonstrates that is possible to use an agroindustrial residue as a sustainable alternative C-source to produce cost-effective biocatalysts with high desulfurization ability. Moreover, strain 1B is able of produce carotenoids and biosurfactants/bioemulsifiers (BS/BE) and cells from the STFr L1 were those that presented the highest production of carotenoids (338±15 g/gDCW) and BS/BE (Emulsifying activity: 8 U/mL). Both carotenoids and BS/BE results open prospects for further bioproducts valorization contributing for the global economic viability of a BDS process considering G. alkanivorans strain 1B biorefinery as an integrative process aiming to get BDS scale-up.
Descrição
Tese de Mestrado, Microbiologia Aplicada, 2022, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências
Palavras-chave
Biodessulfurização Gordonia alkanivorans estirpe 1B Fonte de carbono alternativa Culturas em quimiostato Bioprodutos Teses de mestrado - 2022