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Publicação
On the role of stress granules in autophagy
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Autores
Resumo(s)
Os grânulos de stress (SGs) são foci citoplasmáticos constituídos por mRNAs, fatores de iniciação da tradução e muitas outras proteínas que afetam a função do mRNA, especialmente proteínas ligantes de RNA (RBPs). Estes complexos de ribonucleoproteínas formam-se transientemente em resposta ao stress celular, dissipando-se logo após a remoção do agente de stress, integrando uma estratégia para minimizar os danos relacionados com o stress e potenciar a sobrevivência celular. Molecularmente, a formação de SGs é geralmente despoletada pela fosforilação do fator de iniciação da tradução 2 alfa (eIF2α) culminando no bloqueio da tradução. Além disso, algumas proteínas, entre elas RBPs, são requeridas para a formação e nucleação destes foci, Tão importante quanto a formação de SGs, é também a sua dissociação, que é mediada pela macroautofagia e pela autofagia mediada por chaperonas. Uma vez realizada a dissociação destes grânulos, a tradução é restabelecida e a célula retoma as suas funções normais, com o objetivo de restabelecer a sua homeostasia. Contudo, se o stress persistir, os SGs tornam-se também persistentes e podem conduzir à formação de agregados que se parecem com os agregados patológicos observados em várias doenças neurodegenerativas. De facto, estudos anteriores observaram que mutações nos componentes dos SGs aumentavam a sua tendência para agregar e acumular proteínas malconformadas, alterando as funções normais dos SGs.
A autofagia é um processo catabólico que atua na degradação celular, permitindo a reciclagem dos constituintes citoplasmáticos em materiais bioenergéticos e biosintéticos, para a manutenção da homeostasia celular. A macroautofagia (comumente conhecida apenas por autofagia) depende da formação de novo de vesiculas citoplasmáticas de dupla membrana, os autofagossomas, para sequestrar e transportar os substratos para degradação nos lisossomas. O comprometimento da autofagia é uma característica comum em grande parte das doenças neurodegenerativas, causando um desequilíbrio na homeostasia celular, dada a incapacidade da célula em eliminar agregados proteicos. De facto, a íntima ligação entre a autofagia e os SGs sugere a hipótese de que os SGs poderão contribuir para as doenças neurodegenerativas. Uma vez que os SGs dependem da autofagia para se dissociarem, caso contrário tornam-se persistentes, sugere-se que estes foci contribuam, através dos seus domínios de agregação proteica, para o aumento do tamanho dos agregados de proteínas já em acumulação nestas doenças, efeito potenciado também pela disfunção da via autofágica.
Os exosomas são um tipo de vesiculas extracelulares (EVs) secretados por quase todos os tipos celulares. Estas vesículas de tamanho reduzido possuem uma bicamada lipídica, o que faz com que consigam passar a barreira hematoencefálica. O conteúdo dos exosomas é maioritariamente composto por mRNAs, microRNAs, DNAs, enzimas, moléculas de sinalização, e diferentes proteínas, tornando estas vesiculas importantes do ponto de vista da comunicação intercelular, especialmente porque permitem a coordenação das funções celulares, sendo essenciais para o desenvolvimento e adaptação ambiental dos organismos multicelulares. Apesar da importância da comunicação intercelular mediada por exosomas, alguns estudos sugerem o seu envolvimento na propagação de proteínas tóxicas, entre as quais, proteínas mutadas e com uma conformação deficiente, que podem desencadear a formação de oligómeros e agregados proteicos patológicos. Além disto, estudos anteriores mostraram que defeitos na função autofágica podem desencadear a libertação de vesiculas para o espaço extracelular, promovendo a saída de agregados celulares proteicos e, consequentemente, aliviando o stress proteotóxico. Adicionalmente, também foram fornecidas evidências de que o stress celular poderia desencadear um aumento da libertação de exossomas, de modo a aliviar a tensão celular, o que seria ainda mais importante em situações em que a autofagia está danificada.
As doenças de poliglutaminas são um grupo de doenças raras, hereditárias e progressivas, caracterizadas por uma anormal repetição do trinucleótido citosina-adenina-guanina (CAG), na região codificante de pelo menos nove genes conhecidos. As extensas repetições de CAG são traduzidas numa série de resíduos de glutamina ininterruptos, criando um trato de anormal de poliglutaminas (polyQ) e uma consequente acumulação das respetivas proteínas. Entre estas doenças encontram-se a doença de Huntington (HD), a ataxia espinocerebelosa do tipo 2 (SCA2) e a doença de Machado Joseph (MJD), causadas pela expansão CAG nos genes que codificam as proteínas huntingtina, ataxina-2 e ataxina-3, respetivamente. Embora cada gene tenha o seu próprio limiar de repetições CAG e diferentes localizações cromossomais, as doenças de polyQ partilham algumas características, como por exemplo, a existência de uma correlação positiva entre o número de repetições CAG e a severidade e precocidade dos sintomas, uma instabilidade geracional na transmissão do número de repetições CAG e a tendência dos produtos proteicos para agregar e formar agregados proteicos intracelulares, que são detetadas nos neurónios dos doentes.
O objetivo principal deste projeto foi estudar a dinâmica dos grânulos de stress no contexto das doenças de poliglutaminas, bem como a sua relação com a autofagia e a formação de exossomas.
Neste trabalho observou-se que a indução de stress oxidativo com arsenito de sódio, conduz à formação de grânulos de stress em células neuroblastoma de murganho (N2a), e que essa formação implica a paragem da tradução. A formação de SGs mostrou alterar a dinâmica da localização subcelular das proteínas huntintina e ataxina-2, mas não da ataxina-3. Também, foi possível notar que quando as células estavam expostas ao stress, o número de agregados das proteínas mutantes huntingtina e ataxina-2 aumentava, quando comparado com as condições sem stress. O mesmo não aconteceu com a ataxina-3 mutante. Relativamente à interação entre a autofagia e os grânulos de stress, mostrou-se que o bloqueio da autofagia não afeta a quantidade de células com grânulos, contudo a indução de grânulos de stress afeta a via autofágica. A alteração dos níveis proteicos de LC3b-II e p62 observados com a formação dos SGs, apontam para uma provável interação entre estes e estas proteínas autofágicas, o que constitui um dado interessante no contexto de doenças que apresentem um comprometimento da autofagia. Por outro lado, este trabalho evidenciou que uma indução da autofagia, tanto molecularmente, como farmacologicamente, reduz a quantidade e o tamanho dos grânulos de stress, em células N2a e em fibroblastos humanos de pessoas saudáveis e de doentes de SCA2. Os nossos resultados mostram ainda, embora de forma preliminar, que a presença de SGs altera os níveis de marcadores de exossomas em células que expressam as proteínas polyQ mutantes.
Em suma, este trabalho fornece algumas evidências científicas relativamente ao papel molecular dos SGs na via autofágica e vice-versa, constituindo uma ferramenta para o estudo mais aprofundado dos seus mecanismos de interação, em doenças neurodegenerativas, especialmente nas doenças de poliglutaminas.
Proporciona, também, uma melhor compreensão acerca da possível relação dos SGs com os agregados de proteínas mutantes das doenças HD, SCA2, e MJD, constituindo uma plataforma para futuros estudos nesta área. Por último, os resultados preliminares apresentados neste trabalho, relativamente à interação entre os exossomas, os SGs e as proteínas polyQ mutadas, constituem uma base para futuros estudos que possam relacionar estes intervenientes e compreender a sua relevância na patogénese destas doenças.
Descrição
Tese de mestrado, Neurociências, Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2019
Palavras-chave
Grânulos de stress Autofagia Exossomas PolyQ Agregados proteicos Teses de mestrado - 2019