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Publicação
Testing endosymbiont-mediated immune protection in a novel host species
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The complexity of life forms cannot be explained without the concept of symbiosis. Symbiotic relations exist abundantly in nature, particularly the ones between bacteria and eukaryotic hosts. One of the most widespread endosymbiotic bacteria described belongs to the genus Wolbachia, naturally infecting arthropods and nematodes. In arthropods, Wolbachia induces reproductive manipulations, to promote infected female’s fitness as they are vertically transmitted, maternally. Additionally, in Drosophila melanogaster, they have been shown to confer protection against viral infections. Being an obligatory vertically-transmitted endosymbiont, Wolbachia phylogeny should recapitulate that of its hosts. However, several studies show that host and symbiont phylogenies are not concordant, suggesting that horizontal transfers must have occurred throughout time. This has been confirmed, namely between parasitoid wasps and their hosts. Considering these observations, the present project aimed at uncovering if and at which rate horizontal transmission of Wolbachia could occur between Drosophila melanogaster and its natural parasitoid Leptopilina boulardi. Also, we tested if the viral protection phenotype induced in Drosophila would be passed on to the novel host, after this horizontal transfer event. Simultaneously we screened a wild-caught population of Leptopilina heterotoma for Wolbachia presence. We obtained infected individuals with which we established an isofemale line and derived Wolbachia-negative counterparts using antibiotic treatment. With this tool, we characterized the effects of Wolbachia presence upon viral systemic infection. Our results show that horizontal transmission of Wolbachia happens between Leptopilina boulardi and its host, but the infection is not stably maintained. We also see that these wasps do not appear to be susceptible to viruses that are pathogenic in Drosophila (specifically DCV and FHV) and appear to be mildly Detrimental to Wolbachia-infected Leptopilina heterotoma. Finally, we have verified that a natural endosymbiont infection appears to delay full development time in Leptopilina heterotoma, although no effect is detected for longevity. With this work we have established an experimental system for the controlled and systematic study of the complex interactions between Drosophila, parasitoid wasps, Wolbachia and viruses.
A diversidade de formas devida dificilmente é explicada sem ser tido em conta o conceito de simbiose. Relações simbióticas são abundantemente encontradas em ambientes naturais. Os primeiros eventos de endossimbiose conhecidos terão ocorrido há cerca de 1,5 milhares de milhão de anos atrás. Estes acontecimentos descrevem a incorporação de cianobactérias e proteobactérias ancestrais em organismos procariotas. Quando a simbiose se tornou mutualista obrigatória, estes organismos procariotas associados a endossimbiontes tornaram-se nos primeiros eucariotas do planeta, e os seus anteriormente designados endossimbiontes tornaram‐se organelos, nomeadamente cloroplastos e mitocôndrias. Atualmente existem incontáveis exemplos de organismos vivos que não existiriam se não se estabelecessem relações simbióticas entre diferentes entidades biológicas, constituindo a base para a enorme diversidade de formas de vida existentes. Alguns dos casos mais frequentes de interações entre diferentes organismos que moldam inquestionável e determinantemente a história evolutiva do planeta são os que ocorrem entre procariotas e hospedeiros eucariotas. Estes sistemas podem ser encontrados em todas As circunstâncias, quer em metazoários como plantas e animais, quer em organismos unicelulares. Por exemplo, o filo Porífera realiza incontáveis associações com microrganismos bacterianos que lhe permitem obter nutrientes mais eficazmente ou ainda os vários casos de plantas que formam associações com bactérias fixadoras de azoto. Numa tentativa de classificar os diferentes tipos de interações que podem ocorrer entre dois ou mais organismos, foram atribuídos nomes a categorias discretas que ocorrem no espectro de interações naturais possíveis. Relações simbióticas podem ser comensais, mutualistas ou parasíticas. Comensalismo descreve o tipo de interações em que um organismo beneficia da relação que desenvolve com outro, enquanto o segundo permanece indiferente. Relações mutualistas englobam situações em que a associação é mutualmente benéfica para ambos os envolvidos. Parasitismo implica que um dos envolvidos seja prejudicado, para benefício do outro. Estas duas últimas formas de interação estão intimamente relacionadas, na medida em que as medidas de adaptação que um endossimbionte tem de sofrer para poder invadir e colonizar um hospedeiro, qualquer que seja a interações que acabe por vingar, são semelhantes para uma relação mutualista ou parasita, especialmente se considerarmos as relações abundantes que se estabelecem entre bactérias e hospedeiros eucariotas. No entanto, e apesar das referidas classificações existirem e serem relevantes, é difícil atribuir qualidades discretas a endossimbiontes, uma vez que os efeitos que induzem no seu hospedeiro podem variar entre mutualistas ou patogénicos, consoante vários aspectos (como factores ambientais). Um exemplo privilegiado deste tipo de comportamento variável é o das bactérias do género Wolbachia. Estas são alfa-proteobactérias, membros do grupo Rickettsiales (que engloba todos as bactérias endossimbióticas obrigatórias conhecidas), que infectam artrópodes e algumas espécies de nematodes filariais. Este endossimbionte é um dos mais representados na natureza, infectando mais de 60% de todos os insectos conhecidos, para além de presente em ácaros, aranhas, escorpiões e isópodes. Sendo um dos organismos mais bem estudados atualmente no que diz respeito a relações de simbiose, existem vários estudos que descrevem algumas das adaptações que sofreu de modo a proliferar nas células dos hospedeiros. Nomeadamente, a bactéria utiliza mecanismos de transporte vesicular para viajar dentro das células do hospedeiro. No entanto, a característica deste género que é indubitavelmente mais estudada é a sua capacidade de manipular o sistema reprodutivo do hospedeiro em seu proveito. Existem diferentes formas segundo as quais Wolbachia consegue manipular a reprodução dos seus hospedeiros, nomeadamente: feminização, morte de machos, partenogénese e incompatibilidade citoplasmática (IC). Feminização descreve a transformação fenotípica em fêmeas de organismos geneticamente masculinos; morte de machos acontece quando machos infectados são inviabilizados, disponibilizando mais recursos para as irmãs que possam transmitir a infecção à geração seguinte; partenogénese descreve a produção de prole unicamente feminina contribuição parental masculina; por fim, a manipulação reprodutiva mais comum, a IC descreve o processo segundo o qual fêmeas infetadas geram menos prole viável quando fertilizadas por machos não infetados (ou se ambos hospedarem estirpes incompatíveis). Todos estes processos de manipulação reprodutiva têm como objectivo maximizar a dispersão e colonização de Wolbachia pelo maior número de indivíduos possível, o que por sua vez é conseguido através do favorecimento da descendência feminina. O principal motivo que explica estes processos prende‐se com a forma canónica de transmissão de Wolbachia entre hospedeiros, que é feita verticalmente por via materna. Uma outra influência que Wolbachia exerce sobre os seus hospedeiros prende‐se com a capacidade de proteger Drosophila melanogaster contra (algumas) infeções por vírus de RNA. Esta capacidade foi descrita recentemente (não só para Drosophila mas também para o mosquito Culex pipiens) e desde então múltiplos trabalhos têm sido desenvolvidos na tentativa de caracterizar e determinar os mecanismos subjacentes. É sabido que Wolbachia protege contra Drosophila C Virus (DCV) e Flock House Virus (FHV), entre outros vírus de RNA, mas que a proteção não se estende para vírus de DNA (que não se conhece infectarem naturalmente espécies de Drosophila) e que, inclusive, diferentes níveis de proteção estão associados a diferentes estirpes da bactéria. Outra peculiaridade deste género de endossimbiontes prende-se com a filogenia discordante que apresentam relativamente à dos seus hospedeiros. Tendo em conta que são verticalmente transmitidas, seria de esperar que a árvore filogenética das estirpes de Wolbachia espelhasse, com alguma exatidão, a árvore filogenética dos seus respetivos hospedeiros. Isto não se verifica sugerindo que, além da transmissão vertical, eventos de transmissão horizontal entre hospedeiros têm de ter ocorrido ao longo do tempo. Adicionalmente, estudos baseados nestas filogenias de Wolbachia permitem inferir que existem enormes semelhanças entre as estirpes albergadas por certos insectos filogeneticamente distantes, nomeadamente entre vespas parasitoides e os seus respectivos hospedeiros. Tendo isto em conta, foram conduzidos estudos que determinaram que a bactéria pode ser transmitida horizontalmente entre diferentes hospedeiros por canibalismo de animais infectados, por partilha próxima de nichos ecológicos e através de um vector como uma vespa parasitóide. Reunindo toda a informação apresentada acima, das características da Wolbachia, especificamente da sua capacidade de induzir proteção viral em Drosophila, da sua filogenia discordante (indicativa de eventos de transmissão horizontal) e da existência de casos reportados em que vespas parasitoides atuam como vector transportador de endossimbiontes, formulámos as questões que apresentamos de seguida. 1- Consegue a Wolbachia conferir proteção viral num hospedeiro parasitoide recem-adquirido, fruto de um evento de transmissão horizontal? 2- Está uma população natural de vespas parasitoides protegida contra infecções virais, pela sua estirpe nativa de Wolbachia? 2.1- Como responde esta população natural, em comparação com as vespas mantidas no laboratório? 2.2- Existem custos associados à manutenção de Wolbachia? Começámos por tentar responder à primeira questão estabelecendo linhas isogénicas da vespa Leptopilina boulardi não infectadas por Wolbachia e sujeitando-as a hospedeiros de Drosophila melanogaster contendo Wolbachia. Utilizando duas linhas de moscas infectadas com estirpes individuais diferentes, sujeitámos as vespas a estes hospedeiros infectados e recolhemos toda a descendência após este evento de parasitação. Com estas fêmeas estabelecemos linhas isogénicas, das quais recolhemos, na geração seguinte, indivíduos suficientes que nos permitisse extrair DNA e testar a presença de Wolbachia por PCR. Com estes dados pudemos inferir a taxa de transmissão horizontal entre Leptopilina boulardi e Drosophila melanogaster. Numa tentativa de avaliar se a proteção viral conferida em mosca era transmitida com o endossimbionte para o novo hospedeiro estabelecemos um protocolo de infecção viral sistémica em vespa. No entanto, verificámos que a espécie Leptopilina boulardi não parece ser susceptível aos vírus de RNA que são canonicamente testados em Drosophila. Atestámos também que, nesta espécie, uma transmissão horizontal de Wolbachia não origina uma infecção estável, que seja em última análise, verticalmente mantida. Para responder à questão 2, recolhemos indivíduos da natureza e testámos a presença de Wolbachia assim como determinámos a espécie em questão. Deparamo-nos com uma linha de Leptopilina heterotoma, infectada com Wolbachia. Para estabelecermos um controlo negativo, usámos um tratamento de antibiótico que tratou a infecção, proporcionando duas linhas semelhantes de vespa, uma com e outra sem Wolbachia. Posteriormente, infecção viral foi realizada para esta espécie, onde vimos um efeito pequeno da ação de DCV, apenas detectável na linha que continha a infecção bacteriana de origem mas não na linha tratada. Para determinar custos, realizámos ainda medições quanto ao tempo total de desenvolvimento e longevidade de ambas as linhas de Leptopilina heterotoma, onde detectámos um possível efeito da Wolbachia a atrasar ligeiramente o desenvolvimento de ovo até adulto. Sumariamente, os nossos resultados indicam que a transmissão horizontal de Wolbachia ocorre, embora o estabelecimento de uma infeção vertical estável seja seja, neste caso, indetectável. Concluímos também acerca do efeito que uma infecção viral pode ter (ou não) sobre uma espécie com a qual provavelmente partilha nichos ecológicos na natureza (considerando que tanto Leptopilina boulardi como Leptopilina heterótoma são parasitoides naturais de Drosophila melanogaster, o hospedeiro por excelência de DCV). Podemos ainda verificar que a presença deste endossimbionte pode induzir custos num hospedeiro nativo, como de resto é verificado noutras espécies.
A diversidade de formas devida dificilmente é explicada sem ser tido em conta o conceito de simbiose. Relações simbióticas são abundantemente encontradas em ambientes naturais. Os primeiros eventos de endossimbiose conhecidos terão ocorrido há cerca de 1,5 milhares de milhão de anos atrás. Estes acontecimentos descrevem a incorporação de cianobactérias e proteobactérias ancestrais em organismos procariotas. Quando a simbiose se tornou mutualista obrigatória, estes organismos procariotas associados a endossimbiontes tornaram-se nos primeiros eucariotas do planeta, e os seus anteriormente designados endossimbiontes tornaram‐se organelos, nomeadamente cloroplastos e mitocôndrias. Atualmente existem incontáveis exemplos de organismos vivos que não existiriam se não se estabelecessem relações simbióticas entre diferentes entidades biológicas, constituindo a base para a enorme diversidade de formas de vida existentes. Alguns dos casos mais frequentes de interações entre diferentes organismos que moldam inquestionável e determinantemente a história evolutiva do planeta são os que ocorrem entre procariotas e hospedeiros eucariotas. Estes sistemas podem ser encontrados em todas As circunstâncias, quer em metazoários como plantas e animais, quer em organismos unicelulares. Por exemplo, o filo Porífera realiza incontáveis associações com microrganismos bacterianos que lhe permitem obter nutrientes mais eficazmente ou ainda os vários casos de plantas que formam associações com bactérias fixadoras de azoto. Numa tentativa de classificar os diferentes tipos de interações que podem ocorrer entre dois ou mais organismos, foram atribuídos nomes a categorias discretas que ocorrem no espectro de interações naturais possíveis. Relações simbióticas podem ser comensais, mutualistas ou parasíticas. Comensalismo descreve o tipo de interações em que um organismo beneficia da relação que desenvolve com outro, enquanto o segundo permanece indiferente. Relações mutualistas englobam situações em que a associação é mutualmente benéfica para ambos os envolvidos. Parasitismo implica que um dos envolvidos seja prejudicado, para benefício do outro. Estas duas últimas formas de interação estão intimamente relacionadas, na medida em que as medidas de adaptação que um endossimbionte tem de sofrer para poder invadir e colonizar um hospedeiro, qualquer que seja a interações que acabe por vingar, são semelhantes para uma relação mutualista ou parasita, especialmente se considerarmos as relações abundantes que se estabelecem entre bactérias e hospedeiros eucariotas. No entanto, e apesar das referidas classificações existirem e serem relevantes, é difícil atribuir qualidades discretas a endossimbiontes, uma vez que os efeitos que induzem no seu hospedeiro podem variar entre mutualistas ou patogénicos, consoante vários aspectos (como factores ambientais). Um exemplo privilegiado deste tipo de comportamento variável é o das bactérias do género Wolbachia. Estas são alfa-proteobactérias, membros do grupo Rickettsiales (que engloba todos as bactérias endossimbióticas obrigatórias conhecidas), que infectam artrópodes e algumas espécies de nematodes filariais. Este endossimbionte é um dos mais representados na natureza, infectando mais de 60% de todos os insectos conhecidos, para além de presente em ácaros, aranhas, escorpiões e isópodes. Sendo um dos organismos mais bem estudados atualmente no que diz respeito a relações de simbiose, existem vários estudos que descrevem algumas das adaptações que sofreu de modo a proliferar nas células dos hospedeiros. Nomeadamente, a bactéria utiliza mecanismos de transporte vesicular para viajar dentro das células do hospedeiro. No entanto, a característica deste género que é indubitavelmente mais estudada é a sua capacidade de manipular o sistema reprodutivo do hospedeiro em seu proveito. Existem diferentes formas segundo as quais Wolbachia consegue manipular a reprodução dos seus hospedeiros, nomeadamente: feminização, morte de machos, partenogénese e incompatibilidade citoplasmática (IC). Feminização descreve a transformação fenotípica em fêmeas de organismos geneticamente masculinos; morte de machos acontece quando machos infectados são inviabilizados, disponibilizando mais recursos para as irmãs que possam transmitir a infecção à geração seguinte; partenogénese descreve a produção de prole unicamente feminina contribuição parental masculina; por fim, a manipulação reprodutiva mais comum, a IC descreve o processo segundo o qual fêmeas infetadas geram menos prole viável quando fertilizadas por machos não infetados (ou se ambos hospedarem estirpes incompatíveis). Todos estes processos de manipulação reprodutiva têm como objectivo maximizar a dispersão e colonização de Wolbachia pelo maior número de indivíduos possível, o que por sua vez é conseguido através do favorecimento da descendência feminina. O principal motivo que explica estes processos prende‐se com a forma canónica de transmissão de Wolbachia entre hospedeiros, que é feita verticalmente por via materna. Uma outra influência que Wolbachia exerce sobre os seus hospedeiros prende‐se com a capacidade de proteger Drosophila melanogaster contra (algumas) infeções por vírus de RNA. Esta capacidade foi descrita recentemente (não só para Drosophila mas também para o mosquito Culex pipiens) e desde então múltiplos trabalhos têm sido desenvolvidos na tentativa de caracterizar e determinar os mecanismos subjacentes. É sabido que Wolbachia protege contra Drosophila C Virus (DCV) e Flock House Virus (FHV), entre outros vírus de RNA, mas que a proteção não se estende para vírus de DNA (que não se conhece infectarem naturalmente espécies de Drosophila) e que, inclusive, diferentes níveis de proteção estão associados a diferentes estirpes da bactéria. Outra peculiaridade deste género de endossimbiontes prende-se com a filogenia discordante que apresentam relativamente à dos seus hospedeiros. Tendo em conta que são verticalmente transmitidas, seria de esperar que a árvore filogenética das estirpes de Wolbachia espelhasse, com alguma exatidão, a árvore filogenética dos seus respetivos hospedeiros. Isto não se verifica sugerindo que, além da transmissão vertical, eventos de transmissão horizontal entre hospedeiros têm de ter ocorrido ao longo do tempo. Adicionalmente, estudos baseados nestas filogenias de Wolbachia permitem inferir que existem enormes semelhanças entre as estirpes albergadas por certos insectos filogeneticamente distantes, nomeadamente entre vespas parasitoides e os seus respectivos hospedeiros. Tendo isto em conta, foram conduzidos estudos que determinaram que a bactéria pode ser transmitida horizontalmente entre diferentes hospedeiros por canibalismo de animais infectados, por partilha próxima de nichos ecológicos e através de um vector como uma vespa parasitóide. Reunindo toda a informação apresentada acima, das características da Wolbachia, especificamente da sua capacidade de induzir proteção viral em Drosophila, da sua filogenia discordante (indicativa de eventos de transmissão horizontal) e da existência de casos reportados em que vespas parasitoides atuam como vector transportador de endossimbiontes, formulámos as questões que apresentamos de seguida. 1- Consegue a Wolbachia conferir proteção viral num hospedeiro parasitoide recem-adquirido, fruto de um evento de transmissão horizontal? 2- Está uma população natural de vespas parasitoides protegida contra infecções virais, pela sua estirpe nativa de Wolbachia? 2.1- Como responde esta população natural, em comparação com as vespas mantidas no laboratório? 2.2- Existem custos associados à manutenção de Wolbachia? Começámos por tentar responder à primeira questão estabelecendo linhas isogénicas da vespa Leptopilina boulardi não infectadas por Wolbachia e sujeitando-as a hospedeiros de Drosophila melanogaster contendo Wolbachia. Utilizando duas linhas de moscas infectadas com estirpes individuais diferentes, sujeitámos as vespas a estes hospedeiros infectados e recolhemos toda a descendência após este evento de parasitação. Com estas fêmeas estabelecemos linhas isogénicas, das quais recolhemos, na geração seguinte, indivíduos suficientes que nos permitisse extrair DNA e testar a presença de Wolbachia por PCR. Com estes dados pudemos inferir a taxa de transmissão horizontal entre Leptopilina boulardi e Drosophila melanogaster. Numa tentativa de avaliar se a proteção viral conferida em mosca era transmitida com o endossimbionte para o novo hospedeiro estabelecemos um protocolo de infecção viral sistémica em vespa. No entanto, verificámos que a espécie Leptopilina boulardi não parece ser susceptível aos vírus de RNA que são canonicamente testados em Drosophila. Atestámos também que, nesta espécie, uma transmissão horizontal de Wolbachia não origina uma infecção estável, que seja em última análise, verticalmente mantida. Para responder à questão 2, recolhemos indivíduos da natureza e testámos a presença de Wolbachia assim como determinámos a espécie em questão. Deparamo-nos com uma linha de Leptopilina heterotoma, infectada com Wolbachia. Para estabelecermos um controlo negativo, usámos um tratamento de antibiótico que tratou a infecção, proporcionando duas linhas semelhantes de vespa, uma com e outra sem Wolbachia. Posteriormente, infecção viral foi realizada para esta espécie, onde vimos um efeito pequeno da ação de DCV, apenas detectável na linha que continha a infecção bacteriana de origem mas não na linha tratada. Para determinar custos, realizámos ainda medições quanto ao tempo total de desenvolvimento e longevidade de ambas as linhas de Leptopilina heterotoma, onde detectámos um possível efeito da Wolbachia a atrasar ligeiramente o desenvolvimento de ovo até adulto. Sumariamente, os nossos resultados indicam que a transmissão horizontal de Wolbachia ocorre, embora o estabelecimento de uma infeção vertical estável seja seja, neste caso, indetectável. Concluímos também acerca do efeito que uma infecção viral pode ter (ou não) sobre uma espécie com a qual provavelmente partilha nichos ecológicos na natureza (considerando que tanto Leptopilina boulardi como Leptopilina heterótoma são parasitoides naturais de Drosophila melanogaster, o hospedeiro por excelência de DCV). Podemos ainda verificar que a presença deste endossimbionte pode induzir custos num hospedeiro nativo, como de resto é verificado noutras espécies.
Descrição
Tese de mestrado, Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2015
Palavras-chave
Vespa parasitóide Drosophila melanogaster Wolbachia Transmissão horizontal Proteção viral Teses de mestrado - 2015