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Publicação
Caracterização do sintase do óxido nítrico de Leishmania infantum
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Resumo(s)
O óxido nítrico (NO) desempenha um papel fundamental nos processos de sinalização e infecção por parasitas, tais como tripanossomatídeos. É produzido por uma família de enzimas designados por sintases do óxido nítrico (NOS). Estudos prévios indicam que existe produção de NO em várias espécies de Leishmania, mas nunca foi demonstrada a existência do enzima NOS nem do gene que o codifica nestes organismos. O presente trabalho permitiu identificar um gene que codifica para um NOS de Leishmania infantum, tendo-se expressado a proteína recombinante em bactérias E. coli e optimizado o processo de purificação desta proteína de 64 kDa. A sua actividade enzimática depende de vários cofactores de NOS conhecidos, como FAD, FMN, tetrahidrobiopterina (BH4), calmodulina e cálcio. A tetrahidrobiopterina, uma molécula importante no processo de infecção por Leishmania, modula a actividade do LiNOS de uma forma cooperativa. Determinou-se que o Km para o substrato deste enzima é de 0,9 μM, quando este é pré-incubado com BH4, e que este possui uma actividade específica de 3,8 nmol.min-1.mg-1, sendo a constante catalítica de 4,1 x 10-3 s-1. A expressão do LiNOS em promastigotas foi confirmada por peptide mass fingerprint, mostrando que este enzima deverá ser importante para o ciclo celular do parasita. Este é o primeiro gene NOS e enzima NOS identificados e caracterizados num tripanossomatídeo. Uma vez que os genes NOS de tripanossomatídeos não apresentam semelhanças significativas com os genes NOS de humanos, os enzimas NOS de tripanossomatídeos podem tornar-se possíveis alvos terapêuticos.
Nitric oxide (NO) plays a key role in signaling and infection processes involving parasites, such as trypanosomatids. It is synthesized by a family of enzymes called nitric oxide synthases (NOS). Previous studies showed the production of NO in Leishmania species, but the existence of a NOS enzyme or gene was never demonstrated. We identified a NOS gene in Leishmania infantum, expressed the recombinant protein in E. coli and optimized the purification process of this 64 kDa protein. Its enzymatic activity depends on several known NOS cofactors like FAD, FMN, tetrahydrobiopterin (BH4), calmodulin and calcium. Tetrahydrobiopterin, a key Leishmania infection determinant molecule, modulates LiNOS activity in a positive cooperative way. The enzyme’s Km for its substrate is 0.9 μM, when the protein is pre-incubated with BH4, its specific activity is 3.8 nmol.min-1.mg-1 and its catalytic constant is 4.1 x 10-3 s-1. LiNOS expression in promastigotes was confirmed by peptide mass fingerprint, showing that this enzyme is likely to be required in the parasite’s life cycle. This is the first NOS gene and NOS enzyme identified and characterized in a trypanosomatid. Since trypanosomatid NOS genes show no significant similarity with the human NOS genes, trypanosomatid NOS may become very attractive drug target candidates.
Nitric oxide (NO) plays a key role in signaling and infection processes involving parasites, such as trypanosomatids. It is synthesized by a family of enzymes called nitric oxide synthases (NOS). Previous studies showed the production of NO in Leishmania species, but the existence of a NOS enzyme or gene was never demonstrated. We identified a NOS gene in Leishmania infantum, expressed the recombinant protein in E. coli and optimized the purification process of this 64 kDa protein. Its enzymatic activity depends on several known NOS cofactors like FAD, FMN, tetrahydrobiopterin (BH4), calmodulin and calcium. Tetrahydrobiopterin, a key Leishmania infection determinant molecule, modulates LiNOS activity in a positive cooperative way. The enzyme’s Km for its substrate is 0.9 μM, when the protein is pre-incubated with BH4, its specific activity is 3.8 nmol.min-1.mg-1 and its catalytic constant is 4.1 x 10-3 s-1. LiNOS expression in promastigotes was confirmed by peptide mass fingerprint, showing that this enzyme is likely to be required in the parasite’s life cycle. This is the first NOS gene and NOS enzyme identified and characterized in a trypanosomatid. Since trypanosomatid NOS genes show no significant similarity with the human NOS genes, trypanosomatid NOS may become very attractive drug target candidates.
Descrição
Tese de mestrado, Bioquímica (Bioquímica Médica), Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2010
Palavras-chave
Sintase do óxido nítrico (NOS) Óxido nítrico (NO) Leishmania infantum Leishmaniose visceral (VL) LiNOS Tetrahidrobiopterina (BH4)