A carregar...
Publicação
Exploring the role of MEK5/ERK5 signaling in colon cancer and sensitivity to 5-fluorouracil
| Nome: | Descrição: | Tamanho: | Formato: | |
|---|---|---|---|---|
| 1.9 MB | Adobe PDF |
Autores
Orientador(es)
Resumo(s)
Colon cancer (CC) remains highly ranked in incidence and mortality worldwide. 5-Fluorouracil (5-FU) has been the mainstay for the treatment of CC for several decades. Nevertheless, chemoresistance remains a significant drawback to its clinical success. Therefore, a better understanding of the molecular mechanisms by which tumor cells circumvent 5-FU-induced cytotoxicity may lead to the identification of new therapeutic targets to improve CC treatment. Aberrant MEK5/ERK5 signaling has been reported in several types of human cancer, being associated with increased cell proliferation, survival, and chemoresistance. In CC, MEK5 overactivation was correlated with disease stage progression. Moreover, recent data from our group demonstrated that MEK5 and ERK5 expression is increased in human colon adenomas and adenocarcinomas, suggesting that MEK5/ERK5 signaling overactivation may contribute to CC initiation and progression.
In the present study, using HCT116 and SW620 cells, we produced two stable CC models with differential activation of the MEK5/ERK5 pathway to investigate its role in cell proliferation and response to 5-FU. Our results demonstrate that MEK5 constitutive activation increased CC cell proliferation and KRAS expression, in both HCT116 and SW620 models. In turn, in the HCT116 model, MEK5/ERK5 signaling inhibition, using a dominant-negative MEK5, increased p53 and p21 expression, as well as cell death following 5-FU exposure, which was further associated with increased caspase-3/7 activation and apoptosis. Conversely, constitutive activation of MEK5/ERK5 signaling increased 5-FU chemoresistance, reducing 5-FU-induced cytotoxicity and apoptosis. Interestingly, 5-FU exposure markedly decreased the levels of endogenous MEK5 and ERK5 expression and activation. Finally, our results show that MEK5/ERK5 activation may modulate cell proliferation and sensitivity to 5-FU by downregulating the expression of the tumor-suppressors miR-143/-145/-34a.
Collectively, these data unravel an important interplay between the MEK5/ERK5 pathway and the mechanisms of 5-FU-induced cytotoxicity, suggesting that ERK5-targeted inhibition may provide a promising therapeutic approach for CC treatment, warranting further investigation.
O cancro do cólon (CC) persiste como um dos cancros com maior incidência e mortalidade a nível mundial. De acordo com as estimativas atuais, o cancro do cólon e do reto apresenta-se como a terceira e segunda forma de cancro mais frequente, respetivamente em homens e mulheres. Para além disso, o cancro do cólon e do reto representa atualmente 8 % das mortes relacionadas com cancro, encontrando-se classificado como a quarta forma de cancro com maior mortalidade no mundo. Por fim, prevê-se que o número de novos casos diagnosticados de cancro do cólon e do reto aumente cerca de 30 % até 2020. Apesar dos avanços no tratamento desta neoplasia, os doentes metastáticos apresentam uma taxa de sobrevida a 5 anos limitada a 12 %. A intervenção cirúrgica visando a resseção do tumor primário e dos nódulos linfáticos regionais constitui a base da terapêutica do CC. Após cirurgia, o recurso à quimioterapia para a irradicação de células tumorais residuais irá depender do estadio da doença. Há várias décadas que o tratamento adjuvante do CC tem por base o 5-fluorouracilo (5-FU). No entanto, embora a combinação com novos fármacos antitumorais tenha resultado numa melhoria das taxas de resposta aos esquemas terapêuticos baseados no 5-FU, a resistência a este agente quimioterapêutico mantém-se como uma das principais limitações ao seu sucesso clínico. São bem conhecidos os mecanismos de ação através dos quais o 5-FU induz citotoxicidade, impossibilitando a replicação e reparação do DNA e inibindo a maturação do RNA. Continuam, no entanto, por esclarecer, as vias de sinalização para a inibição do crescimento celular e indução de apoptose moduladas pelo 5-FU, bem como as vias associadas ao desenvolvimento de resistência pelas células tumorais. Este conhecimento poderá revelar-se fundamental para a identificação de doentes com maior probabilidade de resposta a tratamentos com base neste agente quimioterapêutico. Para além disso, deverá contribuir para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas que visem melhorar a eficácia clínica do 5-FU e, consequentemente, o panorama geral do tratamento do CC. O desenvolvimento do cancro é um processo faseado, através do qual as células cancerígenas adquirem progressivamente capacidade de proliferação anormal, resistência à apoptose, invasão de tecidos adjacentes e metastização. De entre as diferentes vias de sinalização implicadas neste processo, a família das MAPKs apresenta-se como uma das mais importantes. Em particular, a sinalização mediada por ERK5 e pela sua proteína ativadora direta MEK5, apresenta características únicas e desempenha um papel fundamental na transdução de sinais extracelulares, culminando na fosforilação e ativação transcricional de proteínas alvo. Desta forma, a via de sinalização MEK5/ERK5 participa na regulação de processos biológicos cruciais, como a proliferação, a diferenciação e a morte celular. O aumento dos níveis de expressão e/ou ativação de MEK5 e ERK5, encontra-se associado a um aumento da agressividade de diversos cancros, tendo sido já demonstrado como um fator de prognóstico desfavorável no cancro da mama e da próstata. No CC a sobre-ativação de MEK5 foi já correlacionada com o estadio da doença. Para além disso, demonstrámos recentemente que as proteínas MEK5 e ERK5 se encontram sobre-expressas em adenomas e adenocarcinomas do cólon, reforçando a noção de que a via de sinalização mediada por estas cinases poderá contribuir para a iniciação e progressão da doença. Mais ainda, a sobre-ativação da sinalização via MEK5/ERK5 mostrou estar associada à resistência aos mecanismos de indução de apoptose despoletados pela ação citotóxica de diversos agentes antitumorais. Em particular, demonstrámos anteriormente que o silenciamento de ERK5 induz apoptose e sensibiliza células de CC para o 5-FU. Os estudos apresentados nesta tese tiveram como principal objetivo a avaliação do papel da sinalização MEK5/ERK5 na modulação da proliferação celular e sensibilidade de células de CC ao tratamento com 5-FU. Para este propósito, utilizando células HCT116 e SW620, foram desenvolvidos dois modelos de CC com sobre-expressão estável de MEK5 constitutivamente ativa ou dominante negativa. Os nossos resultados demonstraram que a ativação constitutiva de MEK5 induz a proliferação celular, aumentando a expressão de KRAS e reduzindo a expressão de p53, tanto no modelo em HCT116 como no modelo em SW620. Por outro lado, em HCT116, a inativação da sinalização via ERK5 resultou na expressão aumentada de p53 e p21. Tendo em conta que a atividade antitumoral do 5-FU depende dos mecanismos de inibição do ciclo celular e indução de apoptose, regulados por p53, estes resultados sugeriram, desde logo, que a via MEK5/ERK5 poderia modular a resposta ao 5-FU. De acordo com esta hipótese, a inativação da via MEK5/ERK5 mostrou sensibilizar células HCT116 para o efeito citotóxico do 5-FU. Em paralelo, esta sensibilização mostrou estar associada a um aumento da atividade das caspases-3 e -7 e, em conformidade, dos níveis de apopotose. Em contrapartida, a ativação constitutiva da via de sinalização MEK5/ERK5 levou a uma diminuição da resposta de células HCT116 ao 5-FU, aumentando a viabilidade celular e reduzindo a apoptose, após exposição a este agente quimioterapêutico. Foi igualmente possível verificar que a exposição ao 5-FU reduziu os níveis endógenos de expressão e ativação de MEK5 e ERK5. Estes resultados indicam a existência de interação entre a sinalização mediada pela via MEK5/ERK5 e os mecanismos de citotoxicidade induzidos pelo 5-FU, cujo balanço poderá ser crucial para a determinação da resposta a este agente antitumoral. A ativação constitutiva de MEK5 mostrou também estar associada à resistência à oxaliplatina, outro agente quimioterapêutico frequentemente utilizado, em combinação com o 5-FU, no tratamento do CC. Os microRNAs (miRNAs) constituem uma classe endógena de pequenos RNAs não codificantes, cujo papel biológico se centra no silenciamento pós-transcricional de genes alvo. A expressão aberrante de miRNAs foi já descrita em vários tipos de cancro, incluindo no CC e encontra-se associada, não só ao processo de carcinogénese, mas também à alteração da sensibilidade celular a agentes quimioterapêuticos. A compreensão dos mecanismos que levam à desregulação dos níveis de expressão dos miRNAs reveste-se, por isso, de particular importância. Assim sendo, avaliámos o efeito da ativação diferencial de MEK5 nos níveis de expressão dos miRNAs supressores de tumor miR-143, miR-145 e miR-34a. O estado de ativação de MEK5/ERK5 mostrou estar inversamente relacionado com a expressão de miR-143/-143/-34a. Estes resultados sugerem que os mecanismos pelos quais a ativação desta via induz a proliferação e reduz a sensibilidade à sinalização apoptótica induzida pelo 5-FU em células de CC poderá, em parte, ser consequência da inibição da expressão destes miRNAs. Em suma, os nossos resultados indicam que a ativação aberrante da via MEK5/ERK5 poderá contribuir para a agressividade e a resistência à quimioterapia, sugerindo que a sua inibição específica poderá constituir uma abordagem terapêutica promissora no tratamento do CC. De futuro, será interessante avaliar os efeitos antitumorais da ação combinada do 5-FU com inibidores químicos seletivos para esta via de sinalização. Para além disso, será também aliciante determinar o potencial da re-introdução dos miR-143/-145, que têm como alvo direto a ERK5, como potencial ferramenta terapêutica para contrabalançar a resistência induzida pela sinalização através desta cinase.
O cancro do cólon (CC) persiste como um dos cancros com maior incidência e mortalidade a nível mundial. De acordo com as estimativas atuais, o cancro do cólon e do reto apresenta-se como a terceira e segunda forma de cancro mais frequente, respetivamente em homens e mulheres. Para além disso, o cancro do cólon e do reto representa atualmente 8 % das mortes relacionadas com cancro, encontrando-se classificado como a quarta forma de cancro com maior mortalidade no mundo. Por fim, prevê-se que o número de novos casos diagnosticados de cancro do cólon e do reto aumente cerca de 30 % até 2020. Apesar dos avanços no tratamento desta neoplasia, os doentes metastáticos apresentam uma taxa de sobrevida a 5 anos limitada a 12 %. A intervenção cirúrgica visando a resseção do tumor primário e dos nódulos linfáticos regionais constitui a base da terapêutica do CC. Após cirurgia, o recurso à quimioterapia para a irradicação de células tumorais residuais irá depender do estadio da doença. Há várias décadas que o tratamento adjuvante do CC tem por base o 5-fluorouracilo (5-FU). No entanto, embora a combinação com novos fármacos antitumorais tenha resultado numa melhoria das taxas de resposta aos esquemas terapêuticos baseados no 5-FU, a resistência a este agente quimioterapêutico mantém-se como uma das principais limitações ao seu sucesso clínico. São bem conhecidos os mecanismos de ação através dos quais o 5-FU induz citotoxicidade, impossibilitando a replicação e reparação do DNA e inibindo a maturação do RNA. Continuam, no entanto, por esclarecer, as vias de sinalização para a inibição do crescimento celular e indução de apoptose moduladas pelo 5-FU, bem como as vias associadas ao desenvolvimento de resistência pelas células tumorais. Este conhecimento poderá revelar-se fundamental para a identificação de doentes com maior probabilidade de resposta a tratamentos com base neste agente quimioterapêutico. Para além disso, deverá contribuir para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas que visem melhorar a eficácia clínica do 5-FU e, consequentemente, o panorama geral do tratamento do CC. O desenvolvimento do cancro é um processo faseado, através do qual as células cancerígenas adquirem progressivamente capacidade de proliferação anormal, resistência à apoptose, invasão de tecidos adjacentes e metastização. De entre as diferentes vias de sinalização implicadas neste processo, a família das MAPKs apresenta-se como uma das mais importantes. Em particular, a sinalização mediada por ERK5 e pela sua proteína ativadora direta MEK5, apresenta características únicas e desempenha um papel fundamental na transdução de sinais extracelulares, culminando na fosforilação e ativação transcricional de proteínas alvo. Desta forma, a via de sinalização MEK5/ERK5 participa na regulação de processos biológicos cruciais, como a proliferação, a diferenciação e a morte celular. O aumento dos níveis de expressão e/ou ativação de MEK5 e ERK5, encontra-se associado a um aumento da agressividade de diversos cancros, tendo sido já demonstrado como um fator de prognóstico desfavorável no cancro da mama e da próstata. No CC a sobre-ativação de MEK5 foi já correlacionada com o estadio da doença. Para além disso, demonstrámos recentemente que as proteínas MEK5 e ERK5 se encontram sobre-expressas em adenomas e adenocarcinomas do cólon, reforçando a noção de que a via de sinalização mediada por estas cinases poderá contribuir para a iniciação e progressão da doença. Mais ainda, a sobre-ativação da sinalização via MEK5/ERK5 mostrou estar associada à resistência aos mecanismos de indução de apoptose despoletados pela ação citotóxica de diversos agentes antitumorais. Em particular, demonstrámos anteriormente que o silenciamento de ERK5 induz apoptose e sensibiliza células de CC para o 5-FU. Os estudos apresentados nesta tese tiveram como principal objetivo a avaliação do papel da sinalização MEK5/ERK5 na modulação da proliferação celular e sensibilidade de células de CC ao tratamento com 5-FU. Para este propósito, utilizando células HCT116 e SW620, foram desenvolvidos dois modelos de CC com sobre-expressão estável de MEK5 constitutivamente ativa ou dominante negativa. Os nossos resultados demonstraram que a ativação constitutiva de MEK5 induz a proliferação celular, aumentando a expressão de KRAS e reduzindo a expressão de p53, tanto no modelo em HCT116 como no modelo em SW620. Por outro lado, em HCT116, a inativação da sinalização via ERK5 resultou na expressão aumentada de p53 e p21. Tendo em conta que a atividade antitumoral do 5-FU depende dos mecanismos de inibição do ciclo celular e indução de apoptose, regulados por p53, estes resultados sugeriram, desde logo, que a via MEK5/ERK5 poderia modular a resposta ao 5-FU. De acordo com esta hipótese, a inativação da via MEK5/ERK5 mostrou sensibilizar células HCT116 para o efeito citotóxico do 5-FU. Em paralelo, esta sensibilização mostrou estar associada a um aumento da atividade das caspases-3 e -7 e, em conformidade, dos níveis de apopotose. Em contrapartida, a ativação constitutiva da via de sinalização MEK5/ERK5 levou a uma diminuição da resposta de células HCT116 ao 5-FU, aumentando a viabilidade celular e reduzindo a apoptose, após exposição a este agente quimioterapêutico. Foi igualmente possível verificar que a exposição ao 5-FU reduziu os níveis endógenos de expressão e ativação de MEK5 e ERK5. Estes resultados indicam a existência de interação entre a sinalização mediada pela via MEK5/ERK5 e os mecanismos de citotoxicidade induzidos pelo 5-FU, cujo balanço poderá ser crucial para a determinação da resposta a este agente antitumoral. A ativação constitutiva de MEK5 mostrou também estar associada à resistência à oxaliplatina, outro agente quimioterapêutico frequentemente utilizado, em combinação com o 5-FU, no tratamento do CC. Os microRNAs (miRNAs) constituem uma classe endógena de pequenos RNAs não codificantes, cujo papel biológico se centra no silenciamento pós-transcricional de genes alvo. A expressão aberrante de miRNAs foi já descrita em vários tipos de cancro, incluindo no CC e encontra-se associada, não só ao processo de carcinogénese, mas também à alteração da sensibilidade celular a agentes quimioterapêuticos. A compreensão dos mecanismos que levam à desregulação dos níveis de expressão dos miRNAs reveste-se, por isso, de particular importância. Assim sendo, avaliámos o efeito da ativação diferencial de MEK5 nos níveis de expressão dos miRNAs supressores de tumor miR-143, miR-145 e miR-34a. O estado de ativação de MEK5/ERK5 mostrou estar inversamente relacionado com a expressão de miR-143/-143/-34a. Estes resultados sugerem que os mecanismos pelos quais a ativação desta via induz a proliferação e reduz a sensibilidade à sinalização apoptótica induzida pelo 5-FU em células de CC poderá, em parte, ser consequência da inibição da expressão destes miRNAs. Em suma, os nossos resultados indicam que a ativação aberrante da via MEK5/ERK5 poderá contribuir para a agressividade e a resistência à quimioterapia, sugerindo que a sua inibição específica poderá constituir uma abordagem terapêutica promissora no tratamento do CC. De futuro, será interessante avaliar os efeitos antitumorais da ação combinada do 5-FU com inibidores químicos seletivos para esta via de sinalização. Para além disso, será também aliciante determinar o potencial da re-introdução dos miR-143/-145, que têm como alvo direto a ERK5, como potencial ferramenta terapêutica para contrabalançar a resistência induzida pela sinalização através desta cinase.
Descrição
Tese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2013
Palavras-chave
Apoptosis Colon cancer ERK5 5-Fluorouracil MEK5 Proliferation Tumor-suppressor miRNAs Teses de mestrado - 2013