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Efficacy of RANK pathway and CDK4/6 inhibition in immune-competent luminal breast cancer models
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Resumo(s)
O cancro de mama é atualmente o cancro com maior incidência mundial, com cerca de 2.3 milhões de novos casos por ano. O cancro da mama é uma doença heterogénea, e os diferentes subtipos têm diferente etiologia, prognóstico e tratamento. O subtipo Luminal A, que se caracteriza por apresentar expressão de recetores hormonais, nomeadamente recetor de estrogénios e progesterona, e ausência de amplificação do oncogene HER2, apesar de ser o subtipo molecular com o melhor prognóstico, é também o mais prevalente e, numa fase avançada/metastática, representa um importante encargo para a saúde a nível mundial. A terapia standard atual para o cancro da mama Luminal A metastático consiste na combinação de terapia endócrina, que interfere com a via de sinalização do recetor de estrogénios, cuja sinalização suporta o potencial de proliferação destas células, com inibidores de ciclinas dependentes de cinases 4/6 (iCDK4/6), cuja função é impedir a progressão do ciclo celular da fase G1 para a fase S. Atualmente, existem três inibidores de CDK4/6 aprovados para o tratamento de cancro da mama metastático, nomeadamente palbociclib, ribociclib e abemaciclib. Embora este tratamento tenha representado um importante avanço no panorama terapêutico deste tipo de cancro, com impacto significativo no aumento da sobrevivência livre de progressão e sobrevivência global, cerca de 20% das doentes não respondem ao tratamento, e virtualmente todas as doentes acabam por progredir devido à resistência adquirida ao mesmo. O nosso grupo tem investigado o papel da via do recetor ativador do fator nuclear kB (RANK) / ligando do recetor ativador do fator nuclear kB (RANKL) na biologia do cancro de mama e resistência à terapêutica. Recentemente, demonstrámos que a sobre expressão de RANK em cancro de mama Luminal está associada à resistência intrínseca aos iCDK4/6, tanto in vitro como em xenotransplantes de ratinhos, destacando-se a diminuição da taxa de proliferação e a resposta crónica via interferão g, mediada pela fosforilação da STAT1 (signal transducer and activator of transcription 1) a jusante de RANK, como implicados na resistência. Adicionalmente, dados de expressão génica do ensaio clínico neoadjuvante com CDK4/6i NeoPalAna e estudos com linhas celulares resistentes ao palbociclib, mostraram que o RANK é regulado positivamente após o tratamento com iCDK4/6, sugerindo um papel desta via na resistência adquirida. Nesse sentido, demonstrámos ainda que inibidores do RANKL podem restaurar a sensibilidade aos iCDK4/6 e mesmo prevenir a resistência adquirida. Estas descobertas sugerem que a inibição farmacológica da via do RANK através do bloqueio do RANKL pode representar um complemento à combinação da terapia endócrina com iCDK4/6. Para além do seu papel na fisiologia e carcinogénese mamárias, nomeadamente na diferenciação e expansão de células da glândula mamária, incluindo células estaminais mamárias, e proliferação aberrante de células basais ou luminais, a via do RANK tem também um papel no sistema imune. Foi inclusivamente neste contexto que esta via foi identificada pela primeira vez, como mediadora de atividade de células T. À luz do conhecimento atual sabe-se que RANK e RANKL são expressos em várias células do sistema imune e estão envolvidos numa ampla variedade de processos imunológicos, regulando respostas imunes inatas e adaptativas, sejam elas imuno-ativadoras ou supressoras, dependendo do contexto. A via do RANK está envolvida em diversas interações imunes, nomeadamente, de células dendríticas e células T e estimula, por exemplo, o desenvolvimento e manutenção das células do timo envolvidas na seleção negativa de células imunes auto-reativas e o desenvolvimento dos nódulos linfáticos. Posto isto, seria de esperar que esta via pudesse ter um efeito na imunidade tumoral. De facto, foi demonstrado que a sinalização do RANK em células tumorais de ratinhos cria um ambiente imunossupressor, impedindo o recrutamento de células T CD8+ ao promover a infiltração de macrófagos e neutrófilos. Este fenótipo é revertido tanto pela inibição genética quanto farmacológica do RANK, levando a um aumento de leucócitos infiltrantes, linfócitos e células T CD8+, o que pode melhorar a resposta à imunoterapia. Um efeito comparável foi observado em pacientes do ensaio D-BEYOND (NCT01864798), tratados com denosumab, um inibidor de RANKL (iRANKL) específico para humanos aprovado para uso clínico, onde a ativação da sinalização do RANK e os níveis séricos de RANKL no início do tratamento podem prever a modulação imune. Para além disso, também os iCDK4/6 apresentam propriedades imunomoduladoras, que parecem ser significativamente benéficas apesar da função de bloqueio do ciclo celular destas drogas. O tratamento com iCDK4/6 foi descrito como tendo o potencial de aumentar o recrutamento de células imunes para o tumor, bem como promover a sua ativação, e induzir maior apresentação de antigénios. Tendo tudo isto em conta e considerando a eficácia no tratamento de cancro de mama Luminal da combinação de iCDK4/6+terapia endócrina com iRANKL em comparação com o tratamento de primeira linha, e os papéis imunomoduladores tanto dos iCDK4/6 quanto do iRANKL, colocámos a hipótese de que a resposta imune mediada pela terapia poderá amplificar o benefício da combinação de iRANKL com iCDK4/6 que observámos anteriormente em modelos imunocomprometidos, merecendo estudos adicionais em modelos imunocompetentes. Neste estudo, caracterizámos dois modelos murinos de cancro da mama Luminal A, MC7- L1 e TS/A-E1, quanto à funcionalidade da via do RANK e sensibilidade a iCDK4/6, terapia endócrina e iRANKL. Também gerámos e caracterizámos modelos com sobre expressão de RANK (RANK OE), e um modelo de resistência adquirida ao palbociclib, que será usado em estudos futuros. Além disso, utilizámos os modelos TS/A-E1 parental e RANK OE para avaliar a eficácia in vivo da combinação de iRANKL e de iCDK4/6, medindo a evolução tumoral e o índice de proliferação celular Ki67 no fim do tratamento. Além disso, caracterizámos o microambiente tumoral quanto ao seu infiltrado imune. Neste caso avaliámos por imunohistoquimica as populações com expressão de CD45, CD3, CD4, CD8, F4/80, CD163 e iNOS. Os nossos resultados mostraram que os modelos singénicos MC7-L1 e TS/A-E1 têm a via de sinalização RANK funcional, proliferam potencialmente através do eixo CDK4/6- Rb, e são também responsivos a todos os inibidores de CDK4/6 aprovados para uso clínico. No entanto, no caso da linha celular TS/A-E1, a resposta não ultrapassa os 40%, o que representa já pouca sensibilidade ao fármaco isoladamente. Apenas a linha celular MC7-L1 apresentou sensibilidade ao degradador do recetor de estrogénios, fulvestrant, que é utilizado na prática clínica em combinação com os iCDK4/6. Segundo estes resultados, ambas as linhas celulares testadas poderão ser usadas para estudos relacionados com a via de sinalização do RANK. O mesmo se verificou com as linhas celulares RANK OE derivadas tanto de MC7-L1 como de TS/A-E1. O principal objetivo deste estudo foi avaliar o efeito de iCDK4/6 combinados com iRANKL no tratamento de cancro da mama Luminal num hospedeiro imunocompetente. Assim, selecionámos as células TS/A-E1, que foram inoculadas no flanco de ratinhos Balb/C, randomizados por grupo de tratamento quando os tumores tinham cerca de 100mm3. Os diferentes grupos foram tratados com 30mg/Kg/dia palbociclib por via oral, 100mg/Kg/3x semana, OPGFc (iRANKL) por injeção intraperitoneal, ou a combinação de ambos. Para comparação, um grupo foi tratado da mesma forma com os excipientes dos fármacos. Os tumores TS/A-E1 parentais tratados com palbociclib e OPG-Fc, apresentaram menor crescimento, aumento da infiltração por linfócitos anti-tumorais (nomeadamente células T CD8+), e menor infiltração por populações imunossupressoras, nomeadamente macrófagos com fenótipo anti-tumoral (“M1-like”), quando comparados com tumores não tratados ou tratados apenas com palbociclib ou OPG-Fc em monoterapia. Estes resultados demonstram a eficácia da terapia combinada num modelo com pouca sensibilidade a iCDK4/6, bem como o papel imunomodulatório dos fármacos utilizados. No entanto, no modelo RANK OE, os efeitos imunes não só foram menos pronunciados, como foram também insuficientes para impedir o crescimento tumoral. Neste caso, estudos adicionais serão essenciais para clarificar estes resultados. No seu conjunto, este estudo demonstrou o papel da modulação imune anti-tumoral da combinação de iCDK4/6 e de RANKL no tratamento de cancro de mama Luminal A. Estas descobertas abrem a porta à caracterização mais detalhada do impacto imune desta proposta de combinação terapêutica no microambiente tumoral, que merece mais estudos no futuro.
Luminal A breast cancer (BC) is the most common molecular subtype of BC; therefore, despite having the best prognosis it still represents a major health burden worldwide at an advanced/metastatic stage. The current standard of care (SoC) therapy for Luminal A metastatic BC (mBC) consists of the combination of endocrine therapy (ET) with cyclindependent kinase 4/6 inhibitors (CDK4/6i) and, although this was a major advance in BC therapy, ca. 20% of patients are intrinsically resistant and virtually all women relapse in the course of treatment due to acquired resistance. Our group has been investigating the role of the receptor activator of nuclear factor-kB (RANK) / receptor activator of nuclear factor-kB ligand (RANKL) pathway in BC biology, and we have recently shown that RANK is involved in both intrinsic and acquired resistance of Luminal BC to CDK4/6i. Moreover, we found that co-targeting the RANK pathway overcomes such resistance. In addition, it has been described that both RANKL inhibitors (RANKLi) and CDK4/6i have immunomodulatory effects that favor an anti-tumor immune response. Stemming from these findings, we hypothesized that such immunomodulatory effects of CDK4/6i and RANKLi would increase the efficacy of this therapeutic combination previously observed in immunocompromised models. To address this hypothesis, we characterized two Luminal A murine syngeneic models, MC7-L1 and TS/A-E1, regarding their RANK pathway activity and sensitivity to CDK4/6i, ET, and RANKLi. To account for the effect of RANK expression levels, we also overexpressed RANK (RANK OE) in these cell lines. The TS/A-E1 model was selected to assess the in vivo efficacy of RANKLi+CDK4/6i and characterize the immune populations present at the tumor microenvironment (TME). Finally, two palbociclibresistant (Palbo_R) cell line models were derived, to be used in future studies. Our results have shown that both MC7-L1 and TS/A-E1 syngeneic models have a functional RANK pathway, CDK4/6-Rb dependent proliferation, and respond to CDK4/6i, although TS/A-E1 cells were less sensitive. However, in vivo, the combination of CDK4/6i and RANKLi (OPG-Fc) was more effective than monotherapy in restraining TS/A-E1 tumor growth. After immunohistochemical (IHC) characterization of immune infiltrates at the TME, we observed an increase in tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) in CDK4/6i or combination-treated tumors, and a decrease in immune-suppressive tumorassociated macrophages (TAMs) in OPG-FC and combination-treated tumors. However, in the RANK OE model, the immune effects were not only less pronounced but also insufficient to allow tumor control or regression. Altogether, our data suggests a synergistic anti-proliferative and an anti-tumoral immunomodulatory effect of the combination of CDK4/6i+RANKLi in Luminal A BC. Besides encouraging, these results support the need for more investigation and characterization of the immune potential of these compounds within the TME.
Luminal A breast cancer (BC) is the most common molecular subtype of BC; therefore, despite having the best prognosis it still represents a major health burden worldwide at an advanced/metastatic stage. The current standard of care (SoC) therapy for Luminal A metastatic BC (mBC) consists of the combination of endocrine therapy (ET) with cyclindependent kinase 4/6 inhibitors (CDK4/6i) and, although this was a major advance in BC therapy, ca. 20% of patients are intrinsically resistant and virtually all women relapse in the course of treatment due to acquired resistance. Our group has been investigating the role of the receptor activator of nuclear factor-kB (RANK) / receptor activator of nuclear factor-kB ligand (RANKL) pathway in BC biology, and we have recently shown that RANK is involved in both intrinsic and acquired resistance of Luminal BC to CDK4/6i. Moreover, we found that co-targeting the RANK pathway overcomes such resistance. In addition, it has been described that both RANKL inhibitors (RANKLi) and CDK4/6i have immunomodulatory effects that favor an anti-tumor immune response. Stemming from these findings, we hypothesized that such immunomodulatory effects of CDK4/6i and RANKLi would increase the efficacy of this therapeutic combination previously observed in immunocompromised models. To address this hypothesis, we characterized two Luminal A murine syngeneic models, MC7-L1 and TS/A-E1, regarding their RANK pathway activity and sensitivity to CDK4/6i, ET, and RANKLi. To account for the effect of RANK expression levels, we also overexpressed RANK (RANK OE) in these cell lines. The TS/A-E1 model was selected to assess the in vivo efficacy of RANKLi+CDK4/6i and characterize the immune populations present at the tumor microenvironment (TME). Finally, two palbociclibresistant (Palbo_R) cell line models were derived, to be used in future studies. Our results have shown that both MC7-L1 and TS/A-E1 syngeneic models have a functional RANK pathway, CDK4/6-Rb dependent proliferation, and respond to CDK4/6i, although TS/A-E1 cells were less sensitive. However, in vivo, the combination of CDK4/6i and RANKLi (OPG-Fc) was more effective than monotherapy in restraining TS/A-E1 tumor growth. After immunohistochemical (IHC) characterization of immune infiltrates at the TME, we observed an increase in tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) in CDK4/6i or combination-treated tumors, and a decrease in immune-suppressive tumorassociated macrophages (TAMs) in OPG-FC and combination-treated tumors. However, in the RANK OE model, the immune effects were not only less pronounced but also insufficient to allow tumor control or regression. Altogether, our data suggests a synergistic anti-proliferative and an anti-tumoral immunomodulatory effect of the combination of CDK4/6i+RANKLi in Luminal A BC. Besides encouraging, these results support the need for more investigation and characterization of the immune potential of these compounds within the TME.
Descrição
Tese de mestrado, Investigação Biomédica, Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2024
Palavras-chave
Cancro da mama luminal A Inibidores de CDK4/6 Via RANK Modelos singénicos Imunomodulação Teses de mestrado - 2024