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Publicação
Dynamics of triad positioning during skeletal myofiber contraction and stretching
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Resumo(s)
A função locomotora do músculo esquelético depende da contratilidade dos sarcómeros, que são compostos por filamentos de actina e de miosina. Durante a contração da célula do músculo, a despolarização da membrana plasmática desencadeia a abertura de canais de cálcio no retículo sarcoplasmático (RS). A libertação de cálcio é fundamental para despoletar o deslizamento dos filamentos de actina sobre a miosina, e, consequentemente, levar ao encurtamento do sarcómero. Para acoplar a excitação e a contração, a rede de membranas que rodeia e invagina as células musculares forma estruturas especializadas chamadas tríade. Estas são compostas por uma invaginação da membrana plasmática, o tubo transversal (túbulo-T), e por duas cisternas terminais do RS de cada lado.
No músculo esquelético de mamíferos, as tríades localizam-se preferencialmente de forma transversal na junção A-I, a interface actina-miosina. A desorganização das tríades é uma característica distintiva das miopatias, como a miopatia centronuclear e a distrofia muscular de Duchenne. No entanto, permanece incerto se as tríades estão estruturalmente ligadas ao sarcómero e se o seu posicionamento é fixo na junção A-I. Para esclarecer estas questões, implementámos um sistema in vitro para visualizar com high-speed e super-resolução o posicionamento das tríades durante a contração muscular. Utilizámos um sistema micropatterned que possibilita a observação de tríades individuais mesmo durante a variação da distância sarcomérica. Além disso, conduzimos experiências ex vivo envolvendo alongamento manual e contração induzida por cloreto de potássio de músculo esquelético. Desta forma, abordamos as mesmas questões agora em tecido muscular totalmente desenvolvido.
Dada a importância fisiológica do posicionamento das tríades na junção A-I, nós antecipamos que estas permaneçam ancoradas nesta região durante a variação do comprimento dos sarcómeros. Surpreendentemente, as tríades exibiram um posicionamento dinâmico, invadindo a região dos filamentos de miosina durante a redução do sarcómero, e afastando-se dela quando o músculo é esticado, refutando a nossa hipótese inicial.
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Uma caracterização mais detalhada do perfil de localização das tríades mostrou potenciais propriedades elásticas, semelhantes às do elemento N2A da Titina. Compreender a correlação entre o posicionamento das tríades e a variação do comprimento dos sarcómeros pode enriquecer a nossa compreensão sobre a natureza da conexão entre tríades e miofibrilas, incluindo as proteínas de ancoragem associadas. Esta informação é útil para o desenvolvimento de intervenções terapêuticas para miopatias caracterizadas por disrupção do posicionamento das tríades.
Skeletal muscle locomotive function relies on the contractility of sarcomeres. Sarcomeres are composed of actin cables with myosin filaments. During muscle cell contraction, plasma membrane depolarisation triggers the opening of calcium channels at the sarcoplasmic reticulum (SR), an important step for actin and myosin cross-bridging, and ultimately sarcomere shortening. To couple excitation and contraction, the network of membranes within skeletal muscle cells forms specialised structures called triads, composed of a plasma membrane invagination, the transverse tubule (T-tubule), flanked by two terminal cisternae of the SR. In mammalian skeletal muscle, triads preferentially locate transversally at the A-I junction, the actin-myosin interface. Mislocalization of triads is a hallmark of myopathies, such as centronuclear myopathy and Duchenne muscular dystrophy. Yet, it remains unclear if triads are structurally linked to the sarcomere and, if so, is the triad positioning fixed at the A-I junction. Therefore, we performed high-speed super-resolution live-cell tracking of triads during muscle cell contraction in an optimised micropatterned in vitro system that facilitates single sarcomere imaging. Additionally, we conducted ex vivo experiments involving manual stretching and potassium chloride-induced contraction of whole skeletal muscle to address this question in fully developed muscle tissue. Given the physiological significance of triad positioning at A-I junction, we anticipate that triads remain tethered at this region during sarcomeric length variation. Surprisingly, triads exhibited a dynamic positioning, invading the myosin filament region during shortening and distancing from it during stretching, refuting our initial hypothesis. Further characterization of the dynamic triad localisation profile showed potential elastic movement, similar to that of Titin’s N2A element. Understanding the correlation between triads positioning and sarcomeric length variation can shed light on the nature of the connection between triads and myofibrils, including associated anchoring proteins. This information is useful for the development of therapeutic interventions for myopathies characterised by triad mispositioning.
Skeletal muscle locomotive function relies on the contractility of sarcomeres. Sarcomeres are composed of actin cables with myosin filaments. During muscle cell contraction, plasma membrane depolarisation triggers the opening of calcium channels at the sarcoplasmic reticulum (SR), an important step for actin and myosin cross-bridging, and ultimately sarcomere shortening. To couple excitation and contraction, the network of membranes within skeletal muscle cells forms specialised structures called triads, composed of a plasma membrane invagination, the transverse tubule (T-tubule), flanked by two terminal cisternae of the SR. In mammalian skeletal muscle, triads preferentially locate transversally at the A-I junction, the actin-myosin interface. Mislocalization of triads is a hallmark of myopathies, such as centronuclear myopathy and Duchenne muscular dystrophy. Yet, it remains unclear if triads are structurally linked to the sarcomere and, if so, is the triad positioning fixed at the A-I junction. Therefore, we performed high-speed super-resolution live-cell tracking of triads during muscle cell contraction in an optimised micropatterned in vitro system that facilitates single sarcomere imaging. Additionally, we conducted ex vivo experiments involving manual stretching and potassium chloride-induced contraction of whole skeletal muscle to address this question in fully developed muscle tissue. Given the physiological significance of triad positioning at A-I junction, we anticipate that triads remain tethered at this region during sarcomeric length variation. Surprisingly, triads exhibited a dynamic positioning, invading the myosin filament region during shortening and distancing from it during stretching, refuting our initial hypothesis. Further characterization of the dynamic triad localisation profile showed potential elastic movement, similar to that of Titin’s N2A element. Understanding the correlation between triads positioning and sarcomeric length variation can shed light on the nature of the connection between triads and myofibrils, including associated anchoring proteins. This information is useful for the development of therapeutic interventions for myopathies characterised by triad mispositioning.
Descrição
Tese de mestrado, Investigação Biomédica, Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2024
Palavras-chave
Músculo esquelético Posicionamento das tríades Contração da miofibra High-speed super-resolução Micropatterning Teses de mestrado - 2024