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Publicação
Super-resolution imaging of the structural maintenance of chromosome (SMC) complexes cohesin and condensin
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Orientador(es)
Resumo(s)
Os complexos proteicos “Structural Maintenance of Chromosomes” (SMC) têm papéis importantes na estrutura cromossómica. Destes, destacam-se a coesina e as condensinas. A coesina mantém os cromatídeos irmãos unidos de modo a permitir a sua fiel segregação enquanto que as condensinas são principalmente responsáveis pela condensação dos cromossomas em preparação para a divisão celular1. A distribuição destes complexos no cromossoma e a sua interacção com outras proteínas associadas ao ADN é actualmente alvo de intensa investigação. Quando os cromossomas estão condensados sabe-se que a condensina aparece num eixo restrito ao longo dos cromatídeos. Sabe-se também que neste período as coesinas estão localizadas maioritariamente na região pericentromérica. Mas não é ainda conhecido se a sua distribuição abrange toda a largura da do centrómero ou, para os dois complexos, se têm uma distribuição restrita centralmente, se pontual ou difusa (figura 3). O limite para perceber a sua distribuição é resultado do limite de resolução das técnicas tradicionais de microscopia óptica. Estas estão limitadas pela difracção da luz a uma resolução de cerca de 200 nm. Embora a microscopia electrónica consiga maior resolução, esta não permite discriminar os complexos de forma selectiva do restante contexto celular2. Como tal, o desenvolvimento de ferramentas que consigam determinar a sua distribuição com maior fiabilidade permitirá novas avenidas de investigação. Com este trabalho monstramos o desenvolvimento de um sistema de microscopia de super-resolução e conjunto de protocolos capazes de obter imagens de super-resolução dos complexos SMC em células de Drosophila melanogaster. Das técnicas que permitem maior resolução desenvolvidas actualmente, as que se baseiam na localização de moléculas individuais (SML, sigla inglesa) são as mais simples de implementar a nível de hardware2. Estas são baseadas no princípio de que a posição de uma molécula pode ser identificada com maior precisão do que a resolução do microscópio. Isto é apenas possível se a molécula estiver individualizada, permitindo que se faça um ajuste a uma curva gaussiana bidimensional a cada fluoróforo individual. Numa amostra fluorescente normal, todos os fluoróforos emitem simultaneamente o que impede a sua discriminação. As diferenças nas variadas técnicas de SML residem na forma de conseguir que apenas uma fracção reduzida dos fluoróforos emita em determinado período de tempo. A técnica de dSTORM baseia-se no facto de que a maioria dos fluoróforos, após excitação com um laser suficientemente forte, entra num estado em que não emitem luz com duração de alguns milissegundos a várias dezenas de segundos. Se for obtido um filme da amostra enquanto esta é exposta à luz de um laser suficientemente intensa, iremos obter um filme dos fluoróforos a piscar. Poderemos então analisar com um algoritmo de localização o filme e identificar todos os fluoróforos presentes na amostra. No final, uma imagem de super-resolução pode ser obtida pela reconstrução dos pontos que foram localizados, pois a sua localização é feita com maior precisão do que a resolução teórica do microscópio3. Um sistema dSTORM, no geral, apenas precisa de um microscópio convencional e um laser suficientemente forte, o que simplifica a sua implementação. Dada a simplicidade dos requerimentos, optou-se por montar um sistema dSTORM para obter imagens dos complexos SMC. Foi obtido um microscópio Nikon com uma objectiva de 100x e 1.45 de abertura numérica (permitindo a melhor colecção de sinal da amostra possível), dado que a precisão da localização depende da quantidade de fotões capturados. A este microscópio foi adaptado um laser de 639nm de comprimento de onda KVANT com 166 mW de potência, permitindo a indução dos estados não-emissores nos fluoróforos presentes na amostra. Simultaneamente foram estabelecidas formas de preparação de amostra que permitam a melhor imagem possível para dSTORM. Principalmente, visto que a espessura da amostra também afecta a qualidade da colecção, foi estabelecido um protocolo para obter preparações de cromossomas em lamelas utilizando o sistema Cytospin. Este consiste numa centrífuga com suportes para lâminas e funis que aceitam as células; quando começa a centrifugar, as células são projectadas na lâmina de modo a obter amostras tão planas quanto possível. Quando as células são tratadas com uma solução hipotónica, o núcleo é rompido e os cromossomas separados. Outra alteração importante ao protocolo normal de imunofluorescência foi a adição de um segundo passo de fixação, no final do protocolo. Isto porque com a exposição a uma fonte de luz de elevada potência (p.ex. um laser) alguns dos fluoróforos destacam-se dos anticorpos a que estão ligados (Ricardo Henriques, comunicação pessoal). Finalmente, em todos os microscópios existe a chamada deriva térmica. Qualquer amostra observada ao microscópio, irá estar a uma temperatura ligeiramente diferente e a sua diferença será equilibrada pela platina que a segura. Dado que a platina e a objectiva costumam ser peças independentes e de materiais diferentes, a amostra irá ser deslocada muito ligeiramente pela deriva térmica da platina ao longo do tempo. Esta deriva é de um valor muito pequeno, mas no decurso de uma aquisição de uma sequência de imagens para subsequente localização, afecta significativamente a reconstrução, a menos que seja corrigida. Para resolver este problema podem incluir-se marcadores na amostra que são depois usados como referência para o algoritmo de reconstrução; este mede a deriva dos marcadores e corrige na tabela de localizações dos pontos. No nosso caso, incluímos sempre microesferas fluorescentes Tetraspeck de 100 nanómetros de diâmetro, que é abaixo da resolução do microscópio. Esta correcção apenas corrige deriva no plano lateral do microscópio, mas o microscópio obtido possui um sistema de correcção de hardware da deriva axial que consegue manter a amostra em foco durante a aquisição. Com este sistema e a nova preparação de amostra, obtivemos imagens de super-resolução da proteína Rad21, uma subunidade da coesina (Figura 10). As reconstruções de Rad21 obtidas mostraram que a proteína se localiza numa zona axialmente restrita com uma largura de sensivelmente 85 nm, consideravelmente abaixo da resolução do microscópio. Vários modelos têm sido descritos para o modo como as coesinas promovem a coesão entre os cromatídios (Figura 2). Destes, o nosso resultado favorece o modelo em que um único anel aprisiona os dois cromatídeos irmãos. Por oposição, este resultado vai contra um modelo alternativo que propõe que dois anéis de coesina estão envolvidos na coesão, cada um rodeando um dos cromatídeos irmãos (Figura 2d). Com este modelo, seria de esperar distribuições de 100 ou mais nanómetros dado que cada anél tem 50 nm de comprimento e estas localizações têm ainda a contribuição do comprimento dos dois anticorpos usados para fazer a marcação (10 a 15 nm cada). Estes resultados, embora promissores, carecem de futura optimização e confirmação uma vez que encontrámos estruturas não-específicas fora dos cromossomas e dos núcleos. Provavelmente estas estruturas devem-se a aglomeração do anticorpo secundário ou a ligação não-específica a proteínas presentes na preparação. De futuro será benéfico efectuar as marcações com fragmentos de anticorpos marcados com fluoróforos orgânicos. Estes são mais específicos e produzem marcações com menos ruído-de-fundo que os anticorpos policlonais tradicionais4. Também são moleculas menores, o que permite diminuir o erro de localização associado à introdução de vários anticorpos de ~10 nanómetros de tamanho na amostra5. Efectivamente, existem fragmentos de anticorpos contra GFP e, o laboratório consegue obter células com marcação GFP em cultura. Também será viável a criação de culturas primárias de cérebros de larvas de drosophila que têm uma percentagem elevada de células em divisão. Estas culturas primárias permitiria aproveitar a diversidade de linhas com marcação GFP existentes no laboratório. Também era objectivo deste trabalho abordar as Condensinas, mas não foi possível dentro do tempo disponível devido a limitações técnicas. Em resumo, descrevemos aqui um sistema e conjunto de protocolos que consegue obter imagens de super-resolução de pelo menos um dos complexos SMC. Imediatamente foi feita uma observação que permite começar a descartar um dos modelos prevalentes propostos para a organização das coesinas e acreditamos que estes são os primeiros passos para um sistema que consiga no futuro obter mais respostas sobre a função e organização dos complexos SMC.
The protein complexes of the “Structural Maintenance of Chromosomes” family have important roles on chromosome structure: cohesin binds sister-chromatids together in order to allow their faithful segregation, and the condensins are responsible for chromosome condensation ahead of cell division, amongst other functions. Their structural distribution along DNA and their interaction with other DNA-bound proteins is currently the subject of intense investigations. This means that the development of tools which are able to determine the distribution of these complexes with greater reliability will allow new avenues of research. We have developed a super-resolution microscopy system and protocols capable of obtaining super-resolution images of the SMC complexes in Drosophila melanogaster cells. With this system we have successfully obtained images of the Rad21 subunit of cohesin and could demonstrate that it is restricted to a small axially defined region demarcating both sisterchromatids. In short, we present a system and protocols which can start to provide answers on the localization and function of the SMC complexes.
The protein complexes of the “Structural Maintenance of Chromosomes” family have important roles on chromosome structure: cohesin binds sister-chromatids together in order to allow their faithful segregation, and the condensins are responsible for chromosome condensation ahead of cell division, amongst other functions. Their structural distribution along DNA and their interaction with other DNA-bound proteins is currently the subject of intense investigations. This means that the development of tools which are able to determine the distribution of these complexes with greater reliability will allow new avenues of research. We have developed a super-resolution microscopy system and protocols capable of obtaining super-resolution images of the SMC complexes in Drosophila melanogaster cells. With this system we have successfully obtained images of the Rad21 subunit of cohesin and could demonstrate that it is restricted to a small axially defined region demarcating both sisterchromatids. In short, we present a system and protocols which can start to provide answers on the localization and function of the SMC complexes.
Descrição
Tese de mestrado. Biologia (Biologia Celular e Biotecnologia). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2013
Palavras-chave
Microscopia de super-resolução Drosophila melanogaster dSTORM Teses de mestrado - 2013