Publicação
Telomere biology in metazoa
| dc.contributor.advisor | Shay, Jerry W., 1945- | en |
| dc.contributor.advisor | Soares, Eduardo Ducla, 1944- | por |
| dc.contributor.author | Gomes, Nuno Miguel Veiga | |
| dc.date | As células somáticas humanas normais exibem uma capacidade proliferativa limitada, um fenómeno conhecido como “limite de Hayflick”. As células fetais dividem-se mais vezes em cultura do que as de uma criança, que por sua vez se dividem mais do que as de um adulto. Os telómeros são os relógios moleculares que permitem às células contarem o seu número de divisões. Os telómeros são as sequências repetitivas de ADN encontradas nos extremos dos cromossomas lineares. Cada um dos 92 telómeros humanos contém milhares de repetições da sequência de seis nucleótidos TTAGGG e as proteínas associadas aos telómeros. O comprimento dos telómeros diminui quer em função da idade dos tecidos do dador, quer com o número de divisões celulares em cultura. A telomerase é uma ribonucleoproteina celular transcriptase reversa que utiliza o seu componente catalítico (hTERT) para sintetizar ADN telomérico (TTAGGG)n directamente nas extremidades dos cromossomas. Em humanos, esta enzima é expressa em tecidos embrionários e em células germinais específicas, mas não é detectada na maioria das células somáticas normais, o que conduz a um encurtamento progressivo dos telómeros que limita o potencial proliferativo das células primárias humanas. Este encurtamento programado dos telómeros - senescência replicativa – funciona como um programa supressor tumoral que gera uma barreira contra o sobrecrescimento tumoral (85% dos tumores humanos possuem actividade da enzima telomerase e são capazes de manter os seus telómeros). Notavelmente, este programa supressor tumoral telomérico não se encontra preservado nas ratazanas e nos ratos de laboratório, que têm telómeros longos e telomerase constitutiva. O estudo presente examina mais de 60 espécies de mamíferos de modo a determinar a distribuição filogenética deste mecanismo supressor tumoral. A expressão de telomerase em culturas de fibroblastos em divisão provenientes de dadores adultos foi usada para determinar a força da repressão da telomerase em células somáticas mesenquimatosas. As células cultivadas em condições não ideais (ex: falta de um micronutriente, oxigénio a 20%), exibem frequentemente uma paragem de divisão chamada estase (“STASIS”- stress or aberrante signaling induced senescence), que é independente do encurtamento telomérico. A presença de estase cedo (dentro de 15 duplicações) também forneceu um fenótipo adicional. Neste estudo examinei a expressão da telomerase, o comprimento dos telómeros, o peso corporal e a longevidade. Usando o resultado da análise de modelos de regressão que levam em linha de conta a ascendência comum, prevista pela filogenia dentro de uma matriz filogenética dos quadrados mínimos (PGLS) verifica-se que a expressão da telomerase se correlaciona de modo significativo com o inverso da massa corporal (p=0.0082), mas não apresenta efeitos independentes com a longevidade (p=0.34). A mesma análise demonstrou que o comprimento dos telómeros apresenta uma significativa correlação negativa com a longevidade (p=0.0032) acima do previsto pela massa corporal por si só, mas não se observou uma associação independente entre o comprimento dos telómeros e a massa corporal (p=0.71). Um controlo rigoroso da senescência replicativa como mecanismo de supressão tumoral requer telómeros curtos juntamente com repressão da telomerase. Contudo, estes resultados sugerem que um decréscimo dos níveis de expressão da telomerase pode, por si só, conferir vantagens à medida que o número de células do corpo aumenta (com o tamanho). Isto pode dever-se à capacidade da telomerase para reparar telómeros que sofreram eventos de deleção “catastróficos” (por exemplo, a expressão da telomerase pode permitir que uma célula pré-maligna em que se encontrem ausentes pontos de controlo celular sobreviva a deleções resultantes de paragens dos garfos de replicação ao nível dos telómeros). Por outro lado, a expressão da telomerase pode ter efeitos adicionais independentes da manutenção dos telómeros. Existe uma correlação bem estabelecida entre a massa corporal e a longevidade. Quando o número de células atinge um certo patamar, a associação independente entre telómeros curtos com um aumento da longevidade sugere que o estabelecimento completo da senescência replicativa é necessário de modo a suprimir a formação tumoral durante períodos de tempo mais prolongados. Observações anteriores levaram a concluir que a expressão da telomerase in vivo decresce com o aumento da massa corporal em roedores, mas não foi observada uma relação com a longevidade quer para a actividade da telomerase, quer para o comprimento telomérico. Os resultados deste projecto demonstram que, numa análise global da classe dos mamíferos, o comprimento telomérico coevolui com a longevidade. O comprimento telomérico ancestral na base dos mamíferos placentários foi reconstruído usando modelos de estimação de probabilidade máxima que geram o valor mais provável na raiz de uma determinada árvore filogenética sob o modelo evolutivo de movimento Browniano juntamente com o parâmetro “lambda”, que mede a força do sinal filogenético. O estado ancestral determinado foi de 18.6 kb com um lambda igual a 1, indicando um signal filogenético muito forte. O estado ancestral de repressão da telomerase foi estimado usando uma matriz de transição probabilística (Markov). A probabilidade de o mamífero placentário ancestral reprimir a telomerase foi calculada como sendo alta (1), em comparação com a probabilidade de a telomerase ter sido expressa (0). Estes resultados permaneceram qualitativamente iguais mesmo se cada ordem for analisada separadamente. A frequência de transição de expressão para repressão foi estimada como sendo perto de zero, o que significa que apenas ocorreram transições de repressão para expressão. Apesar de haver apenas um número limitado de estudos, um extenso grupo de espécies aquáticas poiquilotérmicas (de equinodermes a peixes cartilagíneos ou ósseos) possuem telómeros curtos e expressam a telomerase em muitos dos seus tecidos. No entanto, conseguimos determinar que é provável que o fenótipo ancestral dos mamíferos placentários ancestrais consistisse em ter telómeros curtos e reprimir a enzima telomerase. Isto sugere que uma das primeiras adaptações à homeotermia, (com o aumento da carga mutacional que a acompanha), foi a repressão da telomerase nas células somáticas adultas que possuíam já os telómeros curtos, levando assim ao início do encurtamento telomérico como um mecanismo de protecção tumoral. O mamífero ancestral foi provavelmente mais semelhante aos mamíferos não placentários, mas não foi possível esclarecer por completo o seu fenótipo telomérico. A sequência TTAGGG não possui sítios de restrição. O comprimento telomérico é normalmente determinado pela digestão do ADN genómico com uma mistura de quatro enzimas de restricção reconhecedoras de quatro bases de modo a remover ADN de sequência diversa do lado telomérico interno (centromérico), sendo o tamanho dos telómeros medido em géis de agarose. Os mamíferos não placentários possuem telómeros em que longas extensões de repetições teloméricas foram interrompidas por ADN contendo sítios de restrição. O comprimento dos telómeros de wombats e coalas parece ser menor que 2 kb quando digerido com a nossa mistura de rotina de seis enzimas, mas exibem padrões completamente diferentes quando digeridos com enzimas individuais. O comprimento dos telómeros variou de longo a muito curto dependendo de qual enzima de restrição reconhecedora de quatro bases fosse utilizada para digerir o ADN, não tendo assim sido possível determinar o comprimento telomérico. A natureza das sequências intrateloméricas encontradas nos mamíferos não placentários e se estas reflectem acontecimentos passados de recombinação/inserção ou um processo corrente envolvido na manutenção dos telómeros ainda não foi determinado. Contudo, a ausência de expressão da telomerase por células de coala, a sua paragem de crescimento em cultura após apenas 38 divisões, mesmo após o bloqueio da função de outras barreiras do ciclo celular, e a sua subsequente imortalização após a introdução de hTERT, sugere que pelo menos um marsupial utiliza a senescência replicativa e que apenas a porção mais terminal da sequência telomérica não interrompida se encontra a funcionar neste processo. Acredita-se que as espécies ancestrais de mamíferos eram pequenas. Contudo a maioria das pequenas espécies actuais (com menos de 1 kg) possuem telómeros longos e expressam a telomerase. A análise filogenética sugere que o fenótipo ancestral dos mamíferos consistia em ter telómeros curtos e reprimir a telomerase como uma adaptação inicial à homeotermia, e que a aquisição de telómeros longos conjuntamente com a ausência de repressão da telomerase representam alterações secundárias que proporcionaram vantagens adaptativas a espécies que, ou permaneceram pequenas ou que evoluíram de precursores maiores (tal como se pensa ter ocorrido em morcegos). Estas espécies mais pequenas adquiriram telómeros mais longos e expressão de telomerase pelo menos 5-7 vezes e de modo independente durante a evolução. Uma vantagem pode reflectir um compromisso entre os benefícios da supressão tumoral e os custos de limitar a regeneração. Doenças humanas envolvendo mutações na telomerase causam esgotamento prematuro das células estaminais e uma variedade de doenças associadas com a idade tais como insuficiência esporádica da medula óssea, disqueratose congénita e fibrose pulmonar idiopática, levantando a hipótese de que o encurtamento telomérico pode contribuir para alguns aspectos do envelhecimento humano. Uma vantagem da não utilização da senescência replicativa seria um aumento da capacidade regenerativa. Um compromisso adicional pode ser um investimento mais elevado de recursos destinados à protecção contra o dano oxidativo em espécies com telómeros curtos. Os radicais livres danificam preferencialmente a sequência GGG, que nos mamíferos se encontra presente a cada seis pb nas repetições teloméricas TTAGGG. Além disso, uma propriedade fundamental dos telómeros (a supressão local de indicadores de lesões do ADN de modo a que os extremos de cromossomas lineares não sejam reconhecidos como quebras de cadeia dupla) leva a que lesões teloméricas oxidativas sejam reparadas de um modo muito mais lento do que no restante genoma. Este facto, aumenta a probabilidade de que quebras de cadeias simples sejam convertidas em quebras de cadeia dupla e a consequente perda de sequências teloméricas. Telómeros muito longos (demasiado longos para contar as divisões celulares de modo eficiente), permitem contudo que grandes segmentos teloméricos sejam perdidos sem que seja comprometida a divisão celular. De modo semelhante, a expressão da telomerase poderia permitir a reparação e o alongamento de telómeros com encurtamentos abruptos. A manutenção de telómeros suficientemente curtos para limitar a capacidade proliferativa das células e funcionar como um mecanismo supressor tumoral pode levar a uma necessidade acrescida de investir recursos em mecanismos de protecção oxidativa. Para examinar esta hipótese de trabalho, determinámos a sensibilidade de 15 espécies a dois tipos de stresse oxidativo, tert-Butilhidroperóxido e arseniato de sódio. A relação entre a sensibilidade e o comprimento telomérico como variável independente da massa corporal/longevidade foi significativa usando análise de contraste independente da filogenia para ambos os agentes (tert-Butilhidroperóxido p=0.032; e arseniato de sódio p=0.017). Esta relação também se manteve considerando quer a longevidade, quer a massa como variáveis independentes. A resposta ao arseniato de sódio é mais dramática que ao tert-Butilhidroperóxido. As espécies podem ser agrupadas em dois grupos cuja sensibilidade difere aproximadamente 6 vezes sem que as espécies desta análise limitada exibam valores intermédios. A resistência ao arseniato de sódio foi independente da capacidade das células crescerem bem sob as condições normais de cultura, dado que duas espécies com telómeros curtos que exibiram estase (a baleia cinzenta e o tapir) ainda apresentaram o fenótipo de resistência. Apesar do mecanismo para o diferente comportamento do tert-Butilhidroperóxido e do arseniato de sódio ser desconhecido, pode reflectir compartimentalização celular ou diferentes propensões a lesar lípidos, proteínas ou ADN. Há muito que se colocou a hipótese de as lesões oxidativas serem um dos principais determinantes da longevidade. Os resultados presentes mostrando uma relação de dependência entre o comprimento dos telómeros e o arseniato de sódio / tert-Butilhidroperóxido demonstram que irá ser importante considerar o comprimento telomérico como uma variável independente ao comparar o nível de resistência a diferentes stresses oxidativos como uma função da longevidade. Propõe-se assim que o mecanismo supressor tumoral telomérico representa uma adaptação inicial dos mamíferos ancestrais ao aumento de mutações associado à homeotermia tem vantagens adaptativas em animais grandes / de maior longevidade, mas foi abandonado por muitas espécies. Estas observações resolvem uma longa confusão acerca do uso dos telómeros em humanos e ratos, definem uma importante característica distintiva das ordens filogenéticas em mamíferos, fornecem um cenário crítico para a interpretação de estudos do papel da protecção oxidativa na biologia do envelhecimento, e identificam que mamíferos podem ser usados como organismo modelo apropriado para o estudo do papel dos telómeros no cancro e envelhecimento humanos. | por |
| dc.date.accessioned | 2011-04-14T10:10:19Z | |
| dc.date.available | 2011-04-14T10:10:19Z | |
| dc.date.issued | 2011 | |
| dc.description | Tese de doutoramento, Engenharia Biomédica e Biofísica, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2011 | por |
| dc.description.abstract | Telomerase, the enzyme that maintains telomeres, is absent from most adult human somatic cells, producing a progressive telomere shortening that limits the proliferative potential of primary human cell cultures (Shay and Wright 2007). This programmed telomere shortening, replicative aging, functions as a tumor suppressor program that generates a barrier for the outgrowth of tumors. Remarkably, this telomere tumor suppressor program is not conserved in laboratory rats and mice, which have long telomeres and constitutive telomerase (Sherr and DePinho 2000; Wright and Shay 2000). The present study examines over 60 mammalian species to determine the phylogenetic distribution of the telomere tumor suppressor pathway. Phylogeny based statistical analysis demonstrates that telomere length inversely correlates with lifespan but not body size, while telomerase expression inversely correlates with body size but not lifespan. The ancestral mammalian phenotype was determined to have short telomeres and repressed telomerase. At least 5-7 independent times in different orders smaller, shorter lived species changed to having long telomeres and expressing telomerase, suggesting tradeoffs between the advantages and drawbacks of using replicative aging as a tumor suppression mechanism. We show that one advantage is consistent with reducing the energetic/cellular costs of specific oxidative protection mechanism needed to maintain short telomeres. We propose that the telomere tumor suppressor pathway represents an initial adaptation to the increased mutational load of homeothermy by ancestral mammals, has adaptive advantage in large and long-lived animals, but has been abandoned by many species. These observations resolve a longstanding confusion about the use of telomeres in humans and mice, support a role for telomere length in limiting lifespan, provide a critical framework for interpreting studies of the role of oxidative protection in the biology of aging, and identify which mammals can be used as appropriate model organisms for the study of the role of telomeres in human cancer and aging. | por |
| dc.description.sponsorship | European Union Programs POCI 2010 & FSE and by national funds from the Portuguese Ministry for Science, Technology and Superior Education ((N.M.V.G); Keck Foundation and the National Institute on Aging (W.E.W. & J.W.S.) | por |
| dc.identifier.uri | http://hdl.handle.net/10451/3124 | |
| dc.language.iso | eng | por |
| dc.subject | Evolução (Biologia) | por |
| dc.subject | Telómeros | por |
| dc.subject | Senescência | por |
| dc.subject | Mamíferos | por |
| dc.subject | Teses de doutoramento - 2011 | por |
| dc.title | Telomere biology in metazoa | por |
| dc.type | doctoral thesis | |
| dspace.entity.type | Publication | |
| rcaap.rights | openAccess | por |
| rcaap.type | doctoralThesis | por |