A carregar...
Publicação
Combined ligand and structure-based computational drug discovery of innovative Aquaporin modulators
| Nome: | Descrição: | Tamanho: | Formato: | |
|---|---|---|---|---|
| 9.77 MB | Adobe PDF |
Autores
Orientador(es)
Resumo(s)
As Aquaporinas (AQPs) são uma família de 13 proteínas membranares, cuja principal função é promover o transporte passivo de água, através da célula, em resposta a gradientes osmóticos gerados pelo transporte ativo de solutos [1–3]. As AQPs podem ser divididas em dois grupos, de acordo com os materiais transportados: aquelas que transportam exclusivamente água, que é o caso do nosso objeto de estudo APQ - subtipo 1; e aquelas que para além de água podem transportar pequenos solutos, como por exemplo glicerol [4] - denominadas aquagliceroporinas. Estas proteínas, que possuem a capacidade de atravessar a membrana plasmática, apresentam uma estrutura na forma de um homotetrámero. Cada um dos monómeros inclui um vestíbulo extracelular e citoplasmático, que é conectado através de uma região central, anfipática, designada por poro, num arranjo em forma de barril [5]. Em contraste com a maioria dos canais iónicos, nas AQPs a região do poro não reside no eixo de simetria das quatro subunidades; em vez disso, cada um dos quatro monómeros contém o seu próprio poro [6]. Duas regiões do poro são essenciais para a função das AQPs: a região aromática-arginina, ou filtro de seletividade ar/R, e a região asparagina-prolina-alanina (Asn-Pro-Ala), ou motivo NPA [7]. Tanto o filtro de seletividade ar/R como o motivo NPA participam da exclusão de protões, uma vez que as cargas positivas dos seus resíduos ajudam a repelir a entrada destas partículas no poro da AQP. As AQPs são amplamente expressas em todo o reino animal e vegetal, estando localizadas na membrana plasmática e nos compartimentos citoplasmáticos, particularmente em tipos de células envolvidas no transporte de fluidos. Foi já comprovado que as AQPs desempenham papéis cruciais no desenvolvimento biológico de tumores, estando incluídas na sua histologia, proliferação, migração, angiogénese, e edema associado [8]. Esta correlação é devida ao facto de as AQPs serem sobre expressas nestes tecidos, em comparação com tecidos ditos normais. Consequentemente, as AQPs podem funcionar como potenciais alvos diagnósticos e terapêuticos no tratamento do cancro, uma vez que a sua inibição em células endoteliais e tumorais pode limitar o crescimento e a disseminação do tumor [2,4]. Infelizmente, a taxa de sucesso para a identificação de pequenas moléculas moduladoras de AQPs é muito baixa em comparação com outras proteínas membranares, e os poucos moduladores farmacológicos identificados carecem de especificidade ou acabam por revelar uma alta toxicidade [6]. Uma possível explicação para esta baixa “drogabilidade” é o reduzido tamanho do monómero funcional das AQPs e o pequeno diâmetro do seu poro. No entanto, o contínuo crescimento do conhecimento acerca da relação estrutura-função das AQPs, particularmente da geometria, a nível atómico, dos resíduos hidrofóbicos e hidrofílicos específicos da região dos poros, torna as AQPs um alvo terapêutico promissor para ser futuramente usado em campanhas de descoberta de novos fármacos [5]. Na sua vertente experimental, as campanhas de descoberta de fármacos são reconhecidas por serem muito demoradas, arriscadas, e caras [9]. Felizmente, com os constantes avanços na tecnologia e o aumento da compreensão dos princípios fundamentais das interações proteína-ligando, as etapas iniciais das campanhas de descoberta de fármacos estão agora mais focadas em previsões computacionais, nomeadamente abordagens baseadas no ligando (Ligand-based) e na estrutura (Structure-based). A abordagem baseada no ligando é um método fundamentado no conhecimento e informação, acerca de compostos ativos e inativos, relativamente a um alvo específico [10]. Este método indireto de desenvolvimento de novos fármacos baseia-se na compreensão da ligação de uma determinada molécula a um alvo de interesse. Essa molécula pode então ser usadas para derivar um modelo farmacóforo que determina as características estruturais mínimas indispensáveis que uma outra molécula deve reter para ser capaz de se ligar ao alvo em estudo [11]. O conceito baseado na estrutura é fundamentado na perceção da estrutura tridimensional do alvo biológico, obtida, por exemplo, através de métodos de cristalografia de raios-X [12]. Este método direto de desenvolvimento de fármacos é análogo ao screening de alto rendimento (HTS), onde o conheci mento da estrutura alvo e do ligando é imperativo [13]. Esta abordagem depende de uma filtragem automática de várias moléculas, na procura daquelas que evoquem a resposta biológica desejada. Uma das principais razões pelas quais os fármacos acabam por falhar nos ensaios clínicos é porque o efeito pretendido, no alvo desejado, não é produzido [14]. Desta forma, a identificação apropriada do alvo é uma etapa crucial no desenvolvimento de novos fármacos. Um bom alvo precisa de satisfazer vários critérios: ser eficaz; seguro; atender às necessidades clínicas e comerciais; e, acima de tudo, ser “drogável”. Um alvo “drogável” é acessível ao fármaco em teste e, após a sua ligação ao mesmo, evoca a resposta biológica desejada que é consistente tanto in vitro como in vivo [9]. Posteriormente ao processo de validação do alvo, os ensaios de screening de compostos são desenvolvidos durante a fase de identificação de hits [9]. Um composto pode ser descrito como um hit se mostrar a atividade desejada através de um screening do composto em questão, e se a sua atividade puder ser confirmada após um novo teste. Desta forma, os desafios significativos deste campo incluem a identificação de hits promissores e o desenvolvimento de leads de alta qualidade para um maior desenvolvimento em potenciais candidatos clínicos [10]. Infelizmente, ainda surgem vários desafios nesta área de estudo, incluindo os limites definidos pelas estruturas proteicas disponíveis, o reconhecimento de ligandos de referência para a proteína alvo, a identificação de resultados promissores, e o subsequente desenvolvi mento de compostos de alta qualidade, para melhorias adicionais, em candidatos clínicos. Dito isto, de forma a obter resultados satisfatórios e a superar estas limitações, novas e inovadoras abordagens e métodos computacionais devem ser desenvolvidos. Consequentemente, o trabalho apresentado nesta tese foi focado no desenvolvimento de um novo plano de trabalho computacional assente em vários métodos distintos que combinam abordagens inovadoras, baseadas no ligando e na estrutura, para identificar novos moduladores da AQP1. Na abordagem baseada no ligando, a identificação de novos moduladores da AQP1 foi realizada com base nas características químicas mais importantes descritas a partir de moduladores de AQPs já identificados. Essas mesmas características já foram previamente usadas em campanhas de screening virtual na procura de novos potenciais moduladores terapêuticos, mas com uma eficiência limitada. Para fortalecer a nossa triagem, aplicámos essa mesma abordagem a várias bases de dados, disponíveis comercialmente, para garantir a construção de uma base de dados global de compostos, com a mais ampla diversidade química possível. Juntamente com abordagens de screening virtual, uma combinação com Docking molecular permitiu a identificação de moduladores alternativos para a AQP1. Nesta abordagem, o foco foi na região dos poros da proteína, que é, até ao momento, a região mais importante e caracterizada como “drogável”. No entanto, e como abordagem alternativa, também foi feita a identificação de novas regiões sensíveis a influenciar a função da AQP1. Usando uma abordagem multiconformacional, com base em simulações de Dinâmica Molecular (MD) da AQP1, totalmente incorporada na bicamada fosfolipídica da membrana, tentámos identificar novas regiões-alvo na superfície da proteína. O uso de conformações adicionais de MD da proteína AQP1 é o que distingue o nosso trabalho de estudos previamente descritos nesta área de investigação, e o que nos dá uma vantagem na identificação de novos moduladores. Esta abordagem multi-conformacional foi seguida com o objetivo de encontrar as conformações mais prováveis para uso neste tipo de estudos, superando assim as limitações impostas por um sistema de proteína membranar com diferentes monómeros. Posteriormente, usámos estas regiões em novas campanhas de screening virtual, baseadas na estrutura, semelhantes ao que tem sido descrito anteriormente para a região dos poros. Após uma classificação de eficiência de ligação baseada na energia e caracterização estrutural obtidas a partir do screening baseado na estrutura, foi criada uma pequena lista dos moduladores mais promissores, para a AQP1. Esta lista foi então usada em novos ensaios de afinidade de ligação através de uma abordagem combinada de simulações de Dinâmica Molecular e cálculos MM/PBSA. Esta abordagem permitiu atribuir uma pontuação, e posterior classificação, mais precisas dos compostos mais eficientes que se ligam à AQP1, o que tornou possível a criação de uma pequena lista final de compostos cujo efeito sobre a função desta proteína será avaliado. Para garantir a validade dos resultados obtidos, todas as previsões computacionais realizadas terão, no futuro, a sua contrapartida experimental.
Aquaporins (AQPs) are a family of 13 small integral membrane proteins whose primary function is to promote the passive transport of water across the cell in response to osmotic gradients generated by solutes’ active transport [1–3]. These small membrane-spanning proteins assemble as homo tetramers. Each Monomer comprises an extracellular and cytoplasmic vestibule connected by a central amphipathic pore region in a barrel-like arrangement [5]. AQPs are widely expressed throughout the animal and plant kingdom, being localized in the plasma membrane and the cytoplasmic compartments, particularly in cell types involved in fluid transport. AQPs have been proven to play crucial roles in tumor biology, including histological tumor grade, proliferation, migration, angiogenesis, and tumor associated edema [8]. This correlation is due to AQPs’ over-expression when compared to normal tissues. Taking these facts into account, AQPs are seen as new potential diagnostic and therapeutic targets in anticancer treatment since their inhibition in endothelial and tumor cells might limit tumor growth and spread [2,4]. Unfortunately, the hit rate for identifying small-molecule AQP modulators appears to be very low when compared to other membrane proteins, mainly due to the lack of specificity or high toxicity [6]. One possible explanation for these proteins’ low druggability is the small size of the functional AQP Monomer and its small pore diameter. Nonetheless, the continuous growth of structure function knowledge on AQPs, particularly the atomic-level geometry of specific hydrophobic and hydrophilic residues in the pore region, makes AQPs a promising therapeutic target to be used in future Structure-based drug discovery campaigns [5]. In its experimental aspect, drug discovery campaigns are recognized to be time-consuming, risky, and costly [9]. Fortunately, with the constant advances in technology and the increased understanding of the fundamental principles of protein-ligand interactions, the early stages of drug discovery campaigns are now focused on the use of computational predictions, namely Ligand and Structure-based drug design approaches. Several challenges still arise from this field, including the boundaries defined by the available protein structures, the recognition of reference ligands for the target protein, the identification of promising hits, and the subsequent development of high-quality leads for further improvement into clinical candidates. Therefore, to achieve successful results and overcome these limitations, new and innovative computational approaches and methods must be developed. Consequently, the work presented in this thesis was focused on developing a new computational workflow based on several distinct methods that combine innovative Ligand and Structure-based approaches to identify new AQP1 modulators. The multiconfigurational use of different AQP conformations obtained from Molecular Dynamics simulations distinguishes our work from previously described studies focused on this protein target, giving us a fundamental advantage in identifying new AQP1 modulators. This approach was pursued in order to find the most representative conformations of the protein target that could be used as the reference for subsequent Structure-based virtual Molecular Docking screening campaigns. By using different Molecular Docking approaches, together with various commercially available compound Databases, we have identified a list of compounds with promising activity for AQP1 function modulation. Lastly, to narrow down and sort this list, we have used MM/PBSA methods to determine these compounds’ binding free energy at the previously determined binding regions at the AQP1 surface. In the end, the most promising hits identified under this thesis work will be purchased and experimentally tested as new AQP1 modulators.
Aquaporins (AQPs) are a family of 13 small integral membrane proteins whose primary function is to promote the passive transport of water across the cell in response to osmotic gradients generated by solutes’ active transport [1–3]. These small membrane-spanning proteins assemble as homo tetramers. Each Monomer comprises an extracellular and cytoplasmic vestibule connected by a central amphipathic pore region in a barrel-like arrangement [5]. AQPs are widely expressed throughout the animal and plant kingdom, being localized in the plasma membrane and the cytoplasmic compartments, particularly in cell types involved in fluid transport. AQPs have been proven to play crucial roles in tumor biology, including histological tumor grade, proliferation, migration, angiogenesis, and tumor associated edema [8]. This correlation is due to AQPs’ over-expression when compared to normal tissues. Taking these facts into account, AQPs are seen as new potential diagnostic and therapeutic targets in anticancer treatment since their inhibition in endothelial and tumor cells might limit tumor growth and spread [2,4]. Unfortunately, the hit rate for identifying small-molecule AQP modulators appears to be very low when compared to other membrane proteins, mainly due to the lack of specificity or high toxicity [6]. One possible explanation for these proteins’ low druggability is the small size of the functional AQP Monomer and its small pore diameter. Nonetheless, the continuous growth of structure function knowledge on AQPs, particularly the atomic-level geometry of specific hydrophobic and hydrophilic residues in the pore region, makes AQPs a promising therapeutic target to be used in future Structure-based drug discovery campaigns [5]. In its experimental aspect, drug discovery campaigns are recognized to be time-consuming, risky, and costly [9]. Fortunately, with the constant advances in technology and the increased understanding of the fundamental principles of protein-ligand interactions, the early stages of drug discovery campaigns are now focused on the use of computational predictions, namely Ligand and Structure-based drug design approaches. Several challenges still arise from this field, including the boundaries defined by the available protein structures, the recognition of reference ligands for the target protein, the identification of promising hits, and the subsequent development of high-quality leads for further improvement into clinical candidates. Therefore, to achieve successful results and overcome these limitations, new and innovative computational approaches and methods must be developed. Consequently, the work presented in this thesis was focused on developing a new computational workflow based on several distinct methods that combine innovative Ligand and Structure-based approaches to identify new AQP1 modulators. The multiconfigurational use of different AQP conformations obtained from Molecular Dynamics simulations distinguishes our work from previously described studies focused on this protein target, giving us a fundamental advantage in identifying new AQP1 modulators. This approach was pursued in order to find the most representative conformations of the protein target that could be used as the reference for subsequent Structure-based virtual Molecular Docking screening campaigns. By using different Molecular Docking approaches, together with various commercially available compound Databases, we have identified a list of compounds with promising activity for AQP1 function modulation. Lastly, to narrow down and sort this list, we have used MM/PBSA methods to determine these compounds’ binding free energy at the previously determined binding regions at the AQP1 surface. In the end, the most promising hits identified under this thesis work will be purchased and experimentally tested as new AQP1 modulators.
Descrição
Tese de mestrado em Bioinformática e Biologia Computacional, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2020
Palavras-chave
Aquaporinas Tratamento do cancro Screening virtual Desenvolvimento de fármacos baseado no ligando Desenvolvimento de fármacos baseado na estrutura Teses de mestrado - 2020