A carregar...
Publicação
Approaches to control the COVID-19 pandemic
| Nome: | Descrição: | Tamanho: | Formato: | |
|---|---|---|---|---|
| 1.94 MB | Adobe PDF |
Autores
Orientador(es)
Resumo(s)
O coronavírus da síndrome respiratória aguda grave 2 (SARS-CoV-2), é o agente patogénico responsável pela COVID-19 (do inglês coronavírus disease 2019), a pandemia que já causou mais de 250 milhões de infecções e 5 milhões de mortes em todo o mundo. O SARS-CoV-2 foi detectado e identificado pela primeira vez na cidade de Wuhan, na China, nos finais de 2019. Devido à sua rápida disseminação em vários países, a Organização Mundial de Saúde (OMS) declarou a COVID-19 como Emergência de Saúde Pública de Interesse Internacional (ESPII) e pandemia a 30 de Janeiro e 11 de Março de 2020, respetivamente.
Esta dissertação de mestrado foi elaborada no âmbito de dois projetos que exploraram questões pertinentes e metodologias cruciais para o controlo da atual pandemia. O primeiro projecto teve como principal objectivo determinar a capacidade de anticorpos gerados em resposta à infecção pelo SARS CoV-2 em neutralizar as variantes do vírus. A evolução do novo coronavírus tem sido marcada pelo aparecimento de diversas ariantes, em diferentes países, alguns com rápida disseminação pelo mundo, o que provocou sérias preocupações no seio da comunidade científica internacional devido ao seu potencial de maior transmissibilidade, evasão ao sistema imunitário e severidade da doença relativamente ao vírus original. Como consequência, a OMS classificou quatro dessas variantes como variantes de preocupação (variants of concern - VOCs): Alfa, Beta, Gama e Delta, detectadas pela primeira vez no Reino Unido, África do Sul, Brasil e Índia, respectivamente. Estas variantes possuem e partilham várias mutações na proteína espícula (spike), a proteína responsável pela entrada do vírus nas células (através da ligação ao receptor celular, a enzima conversora da angiotensina 2, conhecida como ACE2) e reconhecimento por anticorpos, sendo por isso o principal alvo das vacinas contra a COVID-19. A monitorização das VOCs e das suas mutações, bem como a compreensão dos mecanismos que conferem ao vírus resistência à acção dos anticorpos neutralizantes gerados por infecção natural e pela
vacinação é crucial para a gestão e controlo da pandemia. Neste sentido, foram feitos ensaios de neutralização in vitro, com soro de pacientes recuperados da COVID-19, de partículas pseudovirais que expressam a proteína spike contendo diferentes combinações das mutações mais prevalentes e reportadas nas VOCs Alfa, Beta e Gama, assim como da variante Kappa, que partilha a mesma linhagem com a variante Delta. Através desta análise pode observar-se que os pseudovírus contendo as mutações das variantes Beta e Gama diminuíram significativamente a capacidade dos anticorpos de neutralizarem a sua entrada nas células comparativamente aos pseudovírus da variante Alfa e da variante selvagem (wild type, WT), confirmando resultados descritos na literatura. Foram também confirmadas e identificadas duas mutações (E484K e S494P) no domínio de ligação da proteína spike ao receptor (receptor binding domain, RBD), capazes de reduzir a capacidade neutralizante dos anticorpos. Observou-se uma diminuição ainda mais acentuada da capacidade neutralizante quando estas mutações foram complementadas com as mutações K417N e N501Y,
conhecidas por aumentar a afinidade ao receptor celular ACE2. Este efeito aditivo sugere a existência
de interacções sinérgicas entre mutações, não só pela regulação da ligação de anticorpos, como também
da capacidade de entrada do vírus. O ensaio de neutralização com pseudovírus descrito neste projecto é
um ensaio de alto rendimento e adequado para experiências em contexto de Laboratórios de Biossegurança de Nível 2 (BSL-2), útil para a monitorização continuada da evolução das variantes do SARS-CoV-2, mas que também pode ser usado para o estudo de outros vírus altamente patogénicos num contexto envolvendo menos riscos biológicos. No segundo projecto avaliaram-se metodologias alternativas de diagnóstico da infecção pelo SARS-CoV-2, tendo como principal objectivo determinar a sensibilidade analítica da testagem molecular portranscrição reversa do RNA viral seguida de reacção em cadeia da polimerase quantitativa (Reverse Transcription – quantitative Polymerase Chain Reaction, RT-qPCR) do SARS-CoV-2, usando a saliva
de uma população pediátrica. O método de diagnóstico padrão para a COVID-19 é a detecção do RNA viral por RT-qPCR em amostras do tracto respiratório superior. As zaragatoas oro e nasofaríngeas são as amostras biológicas de eleição para a detecção do SARS-CoV-2, no entanto a sua colheita é invasiva para crianças, envolvendo riscos acrescidos de biossegurança. A saliva tem sido apontada como uma amostra alternativa em vários estudos, e que poderá ter um grande potencial na testagem e monitorização de crianças, principalmente em contexto escolar. A campanha global de vacinação contra a COVID-19 é uma das estratégias mais promissoras para o controlo e erradicação da atual pandemia. No entanto as crianças abaixo dos 12 anos ainda não são um grupo elegível para a vacinação, o que suscita questões relativamente ao seu papel na transmissão do SARS-CoV-2 e das suas variantes. Apesar da maioria não apresentar sintomas clínicos da doença, são susceptíveis à infecção podendo transmitir o vírus para a comunidade. Neste sentido, metodologias de testagem que sejam facilmente implementadas e não invasivas são cruciais para identificar, conter e controlar os casos de infecção na população pediátrica. Para tal, validou-se o método de testagem molecular do SARS-CoV-2 usando a saliva de uma população adulta hospitalizada, simptomática para a COVID-19 e com amostras emparelhadas de zaragatoa nasofaríngea. Uma vez validado o método, este foi aplicado numa população pediátrica de 85 crianças com idade até 10 anos, tendo sido avaliados dois protocolos: com e sem extracção de RNA viral. Nos adultos, a sensibilidade do teste foi de 100%, tendo sido identificados eficientemente todos os casos de COVID-19, quer no protocolo com extracção, quer no protocolo sem extracção de RNA. Ainda na análise referente aos adultos, obteve-se uma exatidão do método de 98.0% para o protocolo com extracção e 97.9% para o protocolo sem extracção. Nas crianças, quando se comparam os resultados da saliva com os da zaragatoa nasofaríngea, obtiveram-se valores de sensibilidade, especificidade e exatidão de 84.8%, 100% e 91.8%, respectivamente, no protocolo em que se procedeu à extracção de RNA. Relativamente ao protocolo sem extracção de RNA, os mesmos parâmetros foram de 81.8%, 100% e 90.4%. Estes resultados indicam que o método é eficiente em diagnosticar casos de infecções
activas do SARS-CoV-2 em crianças até 10 anos. O método revelou-se igualmente eficaz no protocolo
em que não se procedeu à extracção de RNA, o que pode ser extremamente vantajoso em contextos com
limitações de recursos. A aplicação deste método, bem como a complementaridade com outros testes
como os testes de antigénio depende do contexto, recursos e situação epidemiológica de cada
região/país. Neste sentido, a saliva surge como uma amostra promissora na monitorização da população
e crianças em contexto escolar. Em suma, os dois projectos desenvolvidos nesta dissertação permitiram gerar conhecimento e desenvolver metodologias cruciais no contexto da pandemia da COVID-19. Por ainda ser um problema de saúde pública e ter ainda muitas questões em aberto, as abordagens deste trabalho são pertinentes para o futuro.
The novel human coronavirus SARS-CoV-2 is the causative agent of the COVID-19 pandemic that, to date, resulted in ~250 million infections and over 5 million fatalities. Despite prevention measures and vaccination efforts, the virus remains a public health concern with many outstanding questions related to viral control, evolution, disease understanding and therapy development. We explored two approaches in this study for providing knowledge and tools to better respond to the pandemic. First, we engineered spike-pseudotyped particles to analyse how single and multiple mutations in the spike protein of the different SARS-CoV-2 variants of concern impaired the neutralizing potential of antibodies elicited by natural infection. Pseudoviruses with Alpha (UK) variant and WT spike were efficiently neutralized by convalescent sera antibodies, but those mimicking mutations in Beta (SA) and Gamma (Brazil) variants escaped neutralization significantly. We identified mutations (E484K and S494P) in the receptor-binding domain (RBD) of spike that reduced antibody neutralizing capacity and, when combined with mutations known to increase receptor binding (K417N and N501Y), exacerbated host immune escape. The second project involved using easier, cheaper, but sensitive diagnostic methods for detecting infected people to substitute nasopharyngeal (NP) swabs. We implemented an 98% accurate saliva molecular testing method in adults and asked whether the method was suitable for children up to 10 years old. In children, the sensitivity, specificity, and accuracy were, respectively, 84.8%, 100%, and 91.8% for a protocol with RNA extraction, and 81.8%, 100%, and 90.4% for a protocol without. Thus, saliva molecular testing is suitable to diagnose SARS-CoV-2 infected children up to 10-years-old, even bypassing RNA extraction. In summary, the two projects generated critical tools addressing scientific questions regarding immunity and diagnostic. As SARS-CoV-2 is still a public health challenge with many unanswered questions, the tools developed in this study are pertinent for the future.
The novel human coronavirus SARS-CoV-2 is the causative agent of the COVID-19 pandemic that, to date, resulted in ~250 million infections and over 5 million fatalities. Despite prevention measures and vaccination efforts, the virus remains a public health concern with many outstanding questions related to viral control, evolution, disease understanding and therapy development. We explored two approaches in this study for providing knowledge and tools to better respond to the pandemic. First, we engineered spike-pseudotyped particles to analyse how single and multiple mutations in the spike protein of the different SARS-CoV-2 variants of concern impaired the neutralizing potential of antibodies elicited by natural infection. Pseudoviruses with Alpha (UK) variant and WT spike were efficiently neutralized by convalescent sera antibodies, but those mimicking mutations in Beta (SA) and Gamma (Brazil) variants escaped neutralization significantly. We identified mutations (E484K and S494P) in the receptor-binding domain (RBD) of spike that reduced antibody neutralizing capacity and, when combined with mutations known to increase receptor binding (K417N and N501Y), exacerbated host immune escape. The second project involved using easier, cheaper, but sensitive diagnostic methods for detecting infected people to substitute nasopharyngeal (NP) swabs. We implemented an 98% accurate saliva molecular testing method in adults and asked whether the method was suitable for children up to 10 years old. In children, the sensitivity, specificity, and accuracy were, respectively, 84.8%, 100%, and 91.8% for a protocol with RNA extraction, and 81.8%, 100%, and 90.4% for a protocol without. Thus, saliva molecular testing is suitable to diagnose SARS-CoV-2 infected children up to 10-years-old, even bypassing RNA extraction. In summary, the two projects generated critical tools addressing scientific questions regarding immunity and diagnostic. As SARS-CoV-2 is still a public health challenge with many unanswered questions, the tools developed in this study are pertinent for the future.
Descrição
Tese de Mestrado, Biologia Humana e Ambiente, 2022, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências
Palavras-chave
SARS-CoV-2 Spike Anticorpos neutralizantes Saliva Diagnóstico Teses de mestrado - 2022