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Publicação
Contribuition of different cellular subsets to the adenosine A2a receptor overexpression in the rat brain
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Autores
Resumo(s)
O Sistema Nervoso Central caracteriza-se por uma organização estrutural em sinapses multipartidas, constituídas por diversos tipos celulares que coexistem em contínua inter-relação, estabelecendo a base funcional da homeostasia.
A Adenosina, ao ser um metabolito presente em todos os subtipos celulares, ganha relevância pela sua capacidade de modular a função cerebral através de acções a nível da transmissão sináptica – regulando a libertação de neurotransmissores, excitabilidade pós-sináptica e resposta de vários tipos de receptores – e da fisiologia das células gliais. Esta modulação homeostática é mediada pela acção de quatro receptores pleiotrópicos (A1, A2A, A2B and A3) que activam diferentes vias de transdução, de acordo com o seu grau de activação e localização celular e subcelular. Particularmente a nível do hipocampo, a acção deste importante neuromodulador resulta de um balanço entre as respostas inibitórias dos receptores A1 e os efeitos facilitadores da activação dos receptores A2A.
Os receptores A2A são receptores metabotrópicos excitatórios que, apesar de pouco expressos a nível do hipocampo, actuam como metamoduladores da actividade sináptica, através da regulação da libertação de glutamato, GABA e acetilcolina, aliada à interacção com diversos receptores de neuromoduladores, neurotransmissores e neurotrofinas. Além do controlo da função neuronal, as suas acções estendem-se à função dos astrócitos e da microglia, ocupando uma posição de destaque na modulação das relações funcionais entre diversos tipos celulares.
Diversos estudos relacionam situações de insulto - tais como stress, epilepsia, hipoxia, isquémia e envelhecimento – caracterizadas por um aumento extracelular da concentração de adenosina, com a indução de uma desregulação do sistema adenosinérgico, devido à sobreexpressão de receptores A2A a nível do córtex e hipocampo, levando a fenómenos de excitotoxicidade, retracção dendrítica e alterações da memória e plasticidade sináptica. Embora o mecanismo subjacente a esta sobreexpressão patológica permaneça desconhecido, bem como o subtipo neuronal directamente afectado, sabe-se que este tipo de situações prejudiciais à fisiologia do sistema nervoso induzem alterações que seguem a mesma tendência daquelas que ocorrem com o envelhecimento.
De forma a permitir o estudo da desregulação destes receptores no hipocampo, foi criado um modelo de ratos transgénicos que sobreexpressa o subtipo humano do receptor A2A sob o controlo do promotor da proteína cinase dependente de cálcio/calmodulina (Tg(CaMKII-hA2AR)), permitindo uma sobreexpressão pós-natal a nível dos neurónios do prosencéfalo, que mimetiza o processo patológico decorrente de circunstâncias de insulto. Sabendo que estes animais apresentam alterações semelhantes às do envelhecimento, com consequências a nível cognitivo, sináptico e molecular, o presente estudo teve como objectivo avaliar a contribuição de diversos subtipos celulares para este comprometimento da função do hipocampo.
Em primeiro lugar, de forma a abordar as consequências desta sobrexpressão a nível dos circuitos neuronais do hipocampo, foram efectuadas diversas técnicas de biologia molecular para caracterizar a sua localização neste modelo transgénico, tendo sido confirmado através de imunohistoquímica que estes animais expressam o receptor A2A humano nas projecções axonais de CA3 e a nível de CA1 e do Girus Dentado.
Após esta caracterização, avaliou-se se as alterações induzidas no hipocampo estariam relacionadas com perda neuronal ou modificações na densidade sináptica. Não foram encontradas diferenças significativas no número de neurónios da camada piramidal de CA1 nem nos níveis proteicos de marcadores de densidade sináptica (PSD-95 e SNAP-25) no hipocampo de animais Tg(CaMKII-hA2AR) e WT.
A segunda parte do estudo consistiu na avaliação de possíveis alterações a nível do fenótipo das células da microglia e dos astrócitos, explorando a sua contribuição para o processo patológico.
Procedeu-se à caracterização do fenótipo das células da microglia, através de uma abordagem combinada de Western Blotting, imunohistoquímica e citometria de fluxo. Paralelamente a um aumento significativo de 66.91 ± 24.77% dos níveis proteicos de Iba1 no hipocampo de animais transgénicos, foram encontradas diferenças morfológicas significativas relativas à diminuição da área de influência celular (4,64x108 ± 5,134x107 μm2) e à aquisição de uma morfologia menos arredondada da microglia na região de CA1 de animais transgénicos, comparativamente aos WT.
No entanto, não foram encontradas diferenças significativas em relação ao número de células microgliais e aos níveis de expressão de CD11b.
Os resultados obtidos demonstram que a sobreexpressão neuronal de receptores A2A é suficiente para desencadear alterações ao nível do fenótipo da microglia, semelhantes às que caracterizam as fases iniciais do seu processo de activação. A existência de um estado crónico de activação da microglia pode levar ao estabelecimento de um ambiente pró-inflamatório, devido à libertação de citocinas e mediadores inflamatórios, com possível contribuição para as alterações verificadas ao nível da plasticidade sináptica do hipocampo neste modelo transgénico.
Por fim, procedeu-se à caracterização do fenótipo dos astrócitos, através de Western Blotting e imunohistoquímica. Observou-se uma diminuição da reactividade dos astrócitos, pela diminuição significativa de 20.76 ± 8.019% dos níveis de GFAP no hipocampo de animais transgénicos comparativamente aos WT. No que diz respeito à análise morfológica destas células, não foram encontradas diferenças significativas na densidade, distribuição e morfologia dos astrócitos da região de CA1 entre animais transgénicos e WT.
A sobreexpressão de receptores A2A a nível neuronal induz uma diminuição de reactividade dos astrócitos, consistente com um fenótipo de astenia. A perda de função dos astrócitos é uma característica importante do processo de neurodegeneração, com prejuízo da função neuronal resultante de um desajuste homeostático, nomeadamente ao nível da disfunção dos transportadores de glutamato. Diminuições dos níveis de GFAP estão também correlacionadas com patologia depressiva em humanos e modelos animais, o que é consistente com as características depressivas presentes neste modelo de sobreexpressão de receptores A2A previamente analisadas através de estudos comportamentais. Assim, as alterações verificadas ao nível sináptico e comportamental nos animais transgénicos podem em parte ser explicadas por uma alteração da função dos astrócitos.
O presente trabalho comprova que a sobreexpressão de receptores A2A em neurónios é suficiente para induzir alterações significativas ao nível da função das células gliais. Deste modo, as consequências cognitivas, sinápticas e moleculares que decorrem da desregulação dos receptores A2AR no hipocampo, em contextos de insulto para a fisiologia do sistema nervoso, derivam de uma desregulação conjunta de células neuronais e gliais, num mecanismo semelhante ao do envelhecimento.
Para além de contribuir para melhorar o conhecimento sobre os processos neuropatológicos, este estudo reforça a necessidade de considerar a neurodegeneração como uma consequência da perda de homeostasia, dando igual relevância à contribuição das alterações funcionais, celulares e moleculares a nível neuronal e das células da glia.
Adenosine A2A receptors (A2AR) are excitatory metabotropic receptors that act as metamodulators of synaptic activity in the hippocampus, by influencing the release/uptake of glutamate, GABA and acetylcholine together with the interaction with receptors for other neuromodulators, neurotransmitters and neurotrophic factors and the modulation of glial cell function. Noxious brain conditions, such as stress and aging, are known to induce a dysregulation of adenosinergic system characterized by long-term robust upregulation of A2AR in cortical and hippocampal regions, leading to an imbalance of the overall effect of adenosine with excitotoxixity phenomena, dendritic retraction and memory and synaptic plasticity impairment. Although little is known on the mechanism involved in this A2AR upsurge, different studies have found common features between this type of dysregulation and those found in aged animals, raising an early-aging hypothesis behind neurodegeneration. In order to clarify the involvement of different cellular subsets in the A2AR hippocampal dysregulation, we characterized glial cell phenotype in a model of transgenic rats with a postnatal overexpression of human A2AR conditional to the glutamatergic forebrain neurons (Tg(CaMKIIhA2AR)) that displays age-like alterations in hippocampal function, with cognitive, synaptic and molecular impairments. We found that human A2AR overexpression in forebrain neurons is sufficient to drive significant changes in glial cell function, inducing a primed state of microglia – triggering morphological alterations that resemble early states of activation process – and an asthenic phenotype of astrocytes by decreasing GFAP expression. Therefore, the pathological process of A2AR dysregulation derives from a synergy of synaptic and glial dysfunction that resembles features of hippocampal aging. By highlighting the importance of considering neurodegeneration as a consequence of homeostatic failure, results give relevance to the molecular and cellular changes in glia as well as neurons, when trying to decipher the mechanisms leading to neuropathology, suggesting A2AR as a promising multifactorial tool of therapeutic interest.
Adenosine A2A receptors (A2AR) are excitatory metabotropic receptors that act as metamodulators of synaptic activity in the hippocampus, by influencing the release/uptake of glutamate, GABA and acetylcholine together with the interaction with receptors for other neuromodulators, neurotransmitters and neurotrophic factors and the modulation of glial cell function. Noxious brain conditions, such as stress and aging, are known to induce a dysregulation of adenosinergic system characterized by long-term robust upregulation of A2AR in cortical and hippocampal regions, leading to an imbalance of the overall effect of adenosine with excitotoxixity phenomena, dendritic retraction and memory and synaptic plasticity impairment. Although little is known on the mechanism involved in this A2AR upsurge, different studies have found common features between this type of dysregulation and those found in aged animals, raising an early-aging hypothesis behind neurodegeneration. In order to clarify the involvement of different cellular subsets in the A2AR hippocampal dysregulation, we characterized glial cell phenotype in a model of transgenic rats with a postnatal overexpression of human A2AR conditional to the glutamatergic forebrain neurons (Tg(CaMKIIhA2AR)) that displays age-like alterations in hippocampal function, with cognitive, synaptic and molecular impairments. We found that human A2AR overexpression in forebrain neurons is sufficient to drive significant changes in glial cell function, inducing a primed state of microglia – triggering morphological alterations that resemble early states of activation process – and an asthenic phenotype of astrocytes by decreasing GFAP expression. Therefore, the pathological process of A2AR dysregulation derives from a synergy of synaptic and glial dysfunction that resembles features of hippocampal aging. By highlighting the importance of considering neurodegeneration as a consequence of homeostatic failure, results give relevance to the molecular and cellular changes in glia as well as neurons, when trying to decipher the mechanisms leading to neuropathology, suggesting A2AR as a promising multifactorial tool of therapeutic interest.
Descrição
Tese de mestrado, Neurociências, Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2016
Palavras-chave
Adenosina Receptor A2A Neurodegeneração Microglia Astrócitos Hipocampo Sinapse Teses de mestrado - 2016