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Publicação
The role of Arl GTPases in the infection of macrophages by Salmonella
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Orientador(es)
Resumo(s)
A superfamília Ras de pequenas GTPases é dividida em cinco grandes famílias: Ras, Rho, Arf, Ran e Rab. Quando ligadas a GTP, estas proteínas interagem com diferentes efetores regulando uma grande variedade de funções a jusante, como, por exemplo, transdução de sinal, organização do citoesqueleto e tráfico de vesículas, através de um mecanismo chamado ‘’GTP molecular switch’’. Vários estudos já demonstraram que estas GTPases, nomeadamente as Rab, exercem um papel central durante a fagocitose. As Arl são pequenas GTPases, identificadas com base na sua semelhança com as Arf (daí a sua designação de Arl – ‘’ADP-ribosylation factor-like’’), que ainda permanecem maioritariamente desconhecidas. Sabe-se, no entanto, que existem diferenças estruturais significativas entre as Arf e as Arl, nomeadamente nas regiões que rodeiam o local de ligação aos nucleótidos e nas regiões amino e carboxiterminais que se estendem do domínio da GTPase. Salmonella é uma bactéria intracelular Gram-negativa que infecta humanos, causando febre tifóide e doenças gastrointestinais sendo, portanto, uma grande preocupação de saúde pública a nível global. S. enterica serovar Typhimurium tem sido extensivamente utilizado para estudar os mecanismos moleculares e celulares da virulência de Salmonella. Esta bactéria é capaz de infectar e de se replicar em vários tipos de células, mas encontra-se maioritariamente em macrófagos. Um dos mecanismos de controlo de inúmeras infeções é a fagocitose, que implica a ingestão dos patogénios por fagócitos profissionais formando-se um fagossoma. Este sofre, depois, um processo de maturação que envolve a fusão com diferentes organelos da via endocítica formando-se um fagolisossoma com um ambiente acídico rico em proteases que fornece condições favoráveis para a digestão das partículas. No entanto, Salmonella tira proveito da fagocitose pois, como já referido, ela replica-se intracelularmente (logo necessita de ser internalizada para se replicar). A replicação ocorre num compartimento rodeado por uma membrana conhecido como vacúolo-contendo Salmonella (SCV – ‘’Salmonella-containing vacuole’’), dentro do qual a bactéria se encontra protegida das actividades antimicrobianas das células fagocíticas. Esta replicação intravacuolar depende de interacções espácio-temporalmente reguladas com compartimentos vesiculares celulares do hospedeiro, cuja regulação é feita por sistemas de secreção tipo III. Salmonella codifica dois sistemas de secreção tipo III, SPI1 e SPI2, que são respetivamente ativados durante a invasão da célula hospedeira e durante a replicação (mas não são independentes um do outro). As interacções entre organismos multicelulares e microorganismos envolvem estratégias empregues pelos últimos a fim de sobreviver dentro das células hospedeiras. Uma destas estratégias é o combate à fagocitose, tendo como alvo as pequenas GTPases. De facto, já foi demonstrado que vários microorganismos são capazes de manipular os níveis de Rab GTPases em seu benefício. Apesar das diferenças entre as Arl e as Rab GTPases, é plausível propor que as Arl possam também ser manipuladas por Salmonella (e também Plasmodium berghei e Escherichia coli), exercendo um papel importante na fagocitose, da mesma forma que as Rab o fazem. De facto, um membro das Arl, ARL8B, mostrou ser essencial durante infecções de células hospedeiras por Salmonella, sendo essencial para a maturação do vacúolo-contendo Salmonella e, consequentemente, para a replicação da bactéria. Assim este projecto tem como principal finalidade estudar o papel das Arl GTPases na infecção por Salmonella, estudando também E. coli, visto que é uma bactéria nãopatogénica e P. berghei, que é um parasita que mimetiza a infecção da malária. Desta forma estamos também interessados em comparar as infecções por estes três micróbios. O projecto está dividido em três objectivos: 1. Analisar a expressão das diferentes Arl GTPases em BMDMs (macrófagos derivados de medula óssea) recolhidos de ratinho 2. Analisar se a infecção de BMDMs pelos diferentes micróbios leva a uma alteração da expressão das Arl que são naturalmente expressas por essas células. Como objectivo adicional pretendemos também analisar se infecção dos BMDMs por bactérias patogénicas vs. bactérias não patogénicas e por bactérias vs. parasitas leva a diferenças na possível modulação da expressão dos genes das Arl GTPases 3. Se algumas Arls tiverem a sua expressão alterada pela infecção, estudar se interferir com os níveis dessas Arls (por silenciamento e/ou sobreexpressão) altera a fagocitose ou a replicação de S. Typhimurium. Dos vinte genes que codificam Arl GTPases estudados verificou-se que apenas Arl4c e Arl9 não são expressos em BMDMs, pelo que se prosseguiu o estudo com as restantes 18 Arl GTPases. Na segunda fase do projecto, através de qRT-PCR, verificou-se que é relevante qual o sistema de secreção expresso por Salmonella Typhimurium aquando da infecção, pois observou-se que quando a bactéria expressa o SPI2-T3SS os efeitos são mais significativos, havendo um maior número de Arls que têm os seus níveis aumentados relativamente a bactérias que expressam o SPI1-T3SS. Com o parasita verificou-se também o aumento do nível de algumas Arls, mas tal aumento não foi tão significativo. Apenas Arl10, Arl11, Arl13b e Arl15 não viram os seus níveis aumentados por qualquer micróbio, enquanto Arl4d e Arl14 tiveram os seus níveis sempre aumentados. Deste modo podemos concluir que bactérias e parasitas modulam diferentemente a expressão das Arl GTPases. Adicionalmente, mostramos que o facto da bactéria ser ou não patogénica também tem influência, visto que E. coli teve efeitos menos significativos que S. Typhimurium. Para a terceira fase do projeto, através de silenciamento e/ou sobreexpressão de Arl3, Arl8b, Arl14 e Arl16, estudaram-se os efeitos na fagocitose ou replicação de Salmonella Typhimurium. Através de citometria de fluxo avaliámos a percentagem de células infetadas e a intensidade média de fluorescência de macrófagos infetados tratados com siRNAs específicos para as referidas Arls comparativamente a macrófagos infetados não tratados. Observou-se um aumento da fagocitose e um aparente aumento da replicação quando os macrófagos eram silenciados para Arl8b ou Arl14 quando a infeção por Salmonella durava 2h ou 24h, o que indica um aumento da fagocitose, mas também da replicação. Relativamente ao gene Arl3 parece haver um aumento também da replicação, embora o sucesso do silenciamento desta Arl tenha sido menor, enquanto que na Arl16 não se notam diferenças. Já, por imunofluorescência confirma-se o efeito do silenciamento de Arl8b e de Arl14 no aumento da fagocitose da bactéria e também a ausência de efeitos aquando do silenciamento de Arl16. Os resultados obtidos mostram que P. berghei e E. coli aumentam os níveis de algumas Arl GTPases. Possivelmente, tendo em conta o que se sabe sobre as Rab GTPases, isto servirá como mecanismo de evasão imunitária, nomeadamente como forma de evitar a fagocitose pelos macrófagos. Relativamente à infeção por Salmonella o silenciamento de Arl8b ou de Arl14 conduz a um aumento da fagocitose e, aparentemente, a uma aumento da replicação. Nós propomos uma hipótese em que o aumento da fagocitose justifica o aparente aumento da replicação da bactéria com o silenciamento: na realidade o que acontecerá será que o aparente aumento da replicação é um reflexo da maior fagocitose aquando do silenciamento (estes resultados são suportados por ensaios de citometria de fluxo e imunofluorescência). Na verdade o silenciamento de Arl14 e de Arl8b não conduz a uma alteração da replicação da bactéria, apenas da fagocitose. A Arl8b é essencial para a maturação do SCV, sendo, consequentemente, a sua presença importante para a replicação. Nós justificamos a existência de replicação na ausência da Arl8b devido a um possível mecanismo de compensação com a sua isoforma Arl8a. Desta forma, a Arl8a vai, na ausência da Arl8b, assumir as suas funções. Por sobeexpressão do gene Arl8b não se observaram diferenças na replicação comparativamente com a amostra controlo. Mais uma vez, isto seria um reflexo da menor taxa de fagocitose que se esperaria ocorrer aquando da sobreexpressão desta Arl (as poucas bactérias internalizadas replicar-se-iam, devido à presença de Arl8b, mas não o suficiente para o seu aumento ser maior quando comparado com a amostra controlo). Assim, nós propomos uma hipótese em que o silenciamento de Arl8b ou de Arl14 conduz a um aumento da fagocitose sem, no entanto, afetar a taxa de replicação da bactéria. Adicionalmente, também propomos a possível existência de um mecanismo de compensação entre Arl8a e Arl8b, em que, na ausência de Arl8b, Arl8a pode assumir as suas funções. Resumidamente, as principais conclusões a tirar deste trabalho são: a modulação distinta da expressão das Arl GTPases pelos diferentes micróbios, tal como se verifica nas Rab GTPases; a confirmação de que a Arl8b está envolvida na infeção por Salmonella; pela primeira vez é descrito um envolvimento da Arl14 (e talvez da Arl3) na infeção por Salmonella. Devido ao facto das Arl GTPases ainda serem relativamente desconhecidas estes resultados abrem novos possíveis percursos a investigar, como seja aprofundar o papel da Arl8b e da Arl14 (sem ignorar as restantes GTPases) na infeção pelos três micróbios e, seguidamente, estudar possíveis efetores destas Arls e como eles interagem com moléculas do hospedeiro para benefício do micróbio. Assim, este estudo mostra que o estudo das Arl GTPases é bastante promissor pelo que este deverá ser um campo em expansão nos próximos anos.
Microbes like S. Typhimurium, E. coli and P. berghei have developed mechanisms of immune evasion. To achieve this, these microbes subvert host small proteins, like members of the Rab and Arl families. Therefore, members of the Arl subfamily could be targeted by these pathogens. We confirmed that eighteen of the twenty studied Arls are expressed in macrophages. By qRT-PCR, we also analyzed the expression levels of these eighteen Arls in infected macrophages and observed that all microbes differentially up-regulated the levels of specific Arls. By silencing Arl8b and Arl14 in SPI2-expressing Salmonella-infected macrophages we verified an increase in phagocytosis of the bacteria and an apparent increase in replication. However, we propose that this apparent increase in replication is a consequence of the previous increase in phagocytosis that we also observed. In fact we confirmed that the silencing of Arl8b and Arl14 does not affect replication. Overexpression of Arl8b supports this idea. In the absence of Arl8b replication would occur because its isoform Arl8a would assume its functions. Thus, our results suggest that Arl8b and Arl14 are needed for the avoidance of phagocytosis by Salmonella, but we failed to explain why the bacteria would want to avoid this process, since it is essential for their entry and into macrophages and subsequent replication. In the case of Arl16 silencing, no effects on phagocytosis or replication were found. Arl3 silencing was less efficient, but nevertheless there seems to exist some effect on replication. Surprisingly, we observed no changes in phagocytosis upon Arl3 silencing. Overall this work provides a new insight into the involvement of Arl14 in Salmonella infection and suggests that parasites and bacteria modulate differentially the expression of Arl proteins, possibly as a mechanism to evade the host immune responses. Moreover, this work confirms the importance of Arl8b in Salmonella infection. Furthermore, we also confirmed the fact that Arl proteins are important molecules, whose study will only expand in the future.
Microbes like S. Typhimurium, E. coli and P. berghei have developed mechanisms of immune evasion. To achieve this, these microbes subvert host small proteins, like members of the Rab and Arl families. Therefore, members of the Arl subfamily could be targeted by these pathogens. We confirmed that eighteen of the twenty studied Arls are expressed in macrophages. By qRT-PCR, we also analyzed the expression levels of these eighteen Arls in infected macrophages and observed that all microbes differentially up-regulated the levels of specific Arls. By silencing Arl8b and Arl14 in SPI2-expressing Salmonella-infected macrophages we verified an increase in phagocytosis of the bacteria and an apparent increase in replication. However, we propose that this apparent increase in replication is a consequence of the previous increase in phagocytosis that we also observed. In fact we confirmed that the silencing of Arl8b and Arl14 does not affect replication. Overexpression of Arl8b supports this idea. In the absence of Arl8b replication would occur because its isoform Arl8a would assume its functions. Thus, our results suggest that Arl8b and Arl14 are needed for the avoidance of phagocytosis by Salmonella, but we failed to explain why the bacteria would want to avoid this process, since it is essential for their entry and into macrophages and subsequent replication. In the case of Arl16 silencing, no effects on phagocytosis or replication were found. Arl3 silencing was less efficient, but nevertheless there seems to exist some effect on replication. Surprisingly, we observed no changes in phagocytosis upon Arl3 silencing. Overall this work provides a new insight into the involvement of Arl14 in Salmonella infection and suggests that parasites and bacteria modulate differentially the expression of Arl proteins, possibly as a mechanism to evade the host immune responses. Moreover, this work confirms the importance of Arl8b in Salmonella infection. Furthermore, we also confirmed the fact that Arl proteins are important molecules, whose study will only expand in the future.
Descrição
Tese de mestrado. Biologia (Biologia Molecular e Genética). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2013
Palavras-chave
Salmonella typhimurium Plasmodium berghei Escherichia coli Teses de mestrado - 2013