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Publicação
Listeria monocytogenes biofilms produced under nutrient scarcity and cold stress: disinfectant susceptibility of persistent strains collected from the meat industry in Spain
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Autores
Resumo(s)
Listeria monocytogenes é uma bactéria gram-positiva que pertence ao reino Bacteria, filo Firmicutes, classe Bacilli, ordem Bacillales, família Listeriaceae e género Listeria. Caracteriza-se por ser anaeróbia facultativa e por possuir baixo conteúdo em G+C (38%) no seu genoma, sendo caracterizada por bastonetes curtos não esporulados com 0,4 μm de diâmetro e com comprimento entre 1 a 1,5 μm. Esta bactéria é capaz de crescer na presença de concentrações elevadas de sal (10%), bem como em ambientes com grandes variações de pH (pH 4-9). Possui mobilidade entre 10 ºC e 25 ºC e tem a capacidade de crescer entre 1 e 45 ºC, com uma temperatura ótima entre 30 ºC e 37 ºC. Sendo um patogéneo psicrotrófico, consegue crescer a temperaturas de refrigeração (2-4 °C), o que dificulta o seu controlo na indústria alimentar.
O carácter saprófito de L. monocytogenes torna este organismo muito versátil, tendo sido isolado de uma grande variedade de ambientes: solo, água, esgoto e fezes de animais, bem como de alimentos crus, processados e de produtos refrigerados prontos a comer (Ready-To-Eat (RTE)). Devido ao facto de os produtos RTE serem consumidos sem a necessidade de aquecimento prévio, estes apresentam um elevado risco para o consumidor. O aumento do consumo de produtos RTE, motivado pelas mudanças de hábitos dos consumidores, e as dificuldades existentes no controlo da temperatura, particularmente, na distribuição alimentar, contribuem para a recorrência deste microrganismo na indústria alimentar. A sua presença nos alimentos tem uma importância considerável, quer pela mortalidade que provoca, principalmente em crianças, idosos, grávidas e imunocomprometidos, quer pelos custos associados a despesas hospitalares, indemnizações e retiradas de produtos do mercado.
Nas indústrias de processamento de alimentos, os equipamentos e utensílios são reconhecidos como os principais locais para a aderência microbiana e a formação de biofilme. A aderência de microrganismos a superfícies que estão em contacto com os alimentos, pode levar a potenciais problemas sanitários e económicos, uma vez que os biofilmes atuam como reservatórios de recontaminação. Praticamente todos os microrganismos são capazes de realizar esta aderência e formação de biofilme, sendo L. monocytogenes um dos patogéneos envolvidos em contaminações persistentes nas indústrias alimentares. Sabendo que a maioria dos microrganismos vive na forma de biofilme, urge identificar as vantagens desta estrutura séssil no processo de desinfeção, quando comparado com a forma planctónica. O principal objetivo deste trabalho foi assim comparar a suscetibilidade de biofilmes de estirpes persistentes de L. monocytogenes a dois compostos químicos - cloreto de benzalcónio (BAC) e ácido peracético (PAA) - e a um desinfetante comercial que contém PAA (P3-Oxonia). Foram testadas doze estirpes de L. monocytogenes, das quais nove estirpes recolhidas da indústria de carne espanhola e três estirpes laboratoriais usadas como controlos de resistência ao BAC. De forma a simular as condições ambientais nas indústrias de processamento alimentar, os biofilmes foram produzidos a 25 ºC durante 48 h e a uma temperatura de refrigeração (11 ºC), durante sete dias, em cupões de aço inoxidável (SSC). Para a produção dos biofilmes foram usadas condições que pretenderam similar, quer condições de limpeza mais eficaz, quer condições de limpeza menos eficaz, representada pela incubação dos biofilmes em meio rico diluído (TSB-YE/10) e meio rico (TSB-YE), respetivamente. Os biofilmes foram avaliados pela enumeração de células viáveis em cupões de aço inoxidável. Sempre que necessário, as concentrações e tempos de contato com os desinfetantes foram aumentados de forma a atingir o limiar de redução logarítmica de 4 Log (European Standard EN 13697 2001). Os resultados obtidos mostraram que diferentes condições nutritivas para o crescimento dos biofilmes não se refletiram em diferenças significativas (p > 0.5) na formação dos biofilmes, principalmente quando produzidos a 11 ºC. No entanto, os biofilmes incubados em TSB/10 (25 ºC) e em TSB (11 ºC) mostraram maior suscetibilidade ao BAC e ao P3-Oxonia, sugerindo um processo de desinfeção mais eficiente nestas condições de formação. Estes resultados enfatizam a necessidade de uma limpeza eficiente dos equipamentos e utensílios em uso na indústria alimentar, particularmente aqueles mantidos à temperatura ambiente. Quando comparada a suscetibilidade ao BAC de biofilmes crescidos em condições de riqueza ou de escassez de nutrientes, verificou-se maior diferenciação na resposta ao BAC em biofilmes crescidos sob stress nutritivo, do que em biofilmes crescidos em condições de grande disponibilidade de nutrientes.
A concentração de P3-Oxonia necessária para atingir a redução de 4 Log em todas as estirpes em estudo foi de 2% (v/v) por 10 minutos.
Os resultados dos ensaios de suscetibilidade ao BAC e ao PAA foram comparados com resultados anteriores de suscetibilidade, das mesmas estirpes, na forma planctónica.
No geral, a concentração de BAC e o tempo de exposição dos biofilmes necessários para atingir a redução de 4 Log, foi de 5120 mg/L durante 5 minutos. As estirpes que mostraram maior resistência ao BAC no estado de biofilme incluíram estirpes previamente classificadas no estado planctónico, como resistentes ao BAC (MIC = 20 mg/L) e sensíveis ao BAC (MIC = 1,25-2,5). No caso do PAA, a concentração e o tempo de exposição mais elevados para atingir a redução de 4 Log foi de 2000 mg/L (5 minutos), tendo todas as estirpes a mesma suscetibilidade no estado planctónico (MIC = 200 mg/L).
Os resultados anteriores mostram que, no caso do BAC e do PAA, as concentrações requeridas para atingir a redução de 4 Log no estado de biofilme foram consideravelmente elevadas quando comparadas com a resistência das células na forma planctónica. Isto confirma a ideia de que os biofilmes são dotados de uma maior resistência aos desinfetantes.
A diferença considerável entre os valores de MIC do BAC e as concentrações necessárias para atingir a redução de 4 Log nas células do biofilme sugere que o BAC é um composto menos eficiente na eliminação de biofilmes, quando comparado com o PAA. Esta diferença de eficiência dos dois compostos poderá estar condicionada pelo diferente modo de ação, bem como por distintas respostas bacterianas ao stress. O PAA caracteriza-se pela sua capacidade oxidativa e pela elevada reatividade através da geração de aniões superóxido e radicais hidroxilo que afetam o DNA bacteriano e outros constituintes celulares. A sua baixa massa molecular constitui uma vantagem aquando da penetração no biofilme. Pelo contrário, o BAC é um agente que atua essencialmente na membrana celular e o estado de biofilme surge como uma barreira física à penetração do BAC nas células. Isto ocorre quer pela elevada massa molecular do BAC, quer pela presença do glicocálix, de natureza polianiónica, que neutraliza o BAC retendo-o, e reduzindo assim a sua capacidade de difusão na matriz do biofilme dificultando o alcance das células.
Sete das 12 estirpes usadas neste trabalho possuem marcadores de resistência ao BAC: três possuem o gene qacH, enquanto quatro estirpes apresentam o gene bcrAB. No entanto, os ensaios de suscetibilidade dos biofilmes mostraram que das cinco estirpes mais resistentes ao BAC, apenas uma delas possui um destes marcadores genéticos. Estes resultados indicam que estirpes com marcadores de resistência como bcrABC e qacH não apresentam necessariamente menor suscetibilidade ao BAC no estado de biofilme.
No presente trabalho, a ação do desinfetante foi considerada eficaz quando se registou uma redução de células do biofilme de 4 Log. Outros autores têm sugerido que tal eficácia apenas se verifica quando há uma redução de 5 Log. Considerando este requisito, a concentração mais elevada de BAC aplicada, 5120 mg/L (5 minutos), não seria suficiente para eliminar nenhum dos biofilmes das 12 estirpes testadas. Estes resultados sugerem que a persistência de L. monocytogenes na indústria alimentar poderá não estar relacionada com fenómenos de resistência das bactérias aos desinfetantes, mas com a aplicação de concentrações dos desinfetantes insuficientes para eliminar biofilmes. Os resultados aqui apresentados enfatizam a necessidade de trabalhos futuros com vista à clarificação da suscetibilidade de biofilmes a desinfetantes. A escolha do desinfetante, as condições de aplicação que incluem a concentração aplicada e o tempo de exposição deverão ser os adequados à erradicação de biofilmes na indústria alimentar.
The contamination of food products with Listeria monocytogenes has been related to the presence of biofilms in the production lines, since biofilms can protect the cells from the action of sanitizers. The main goal of this work was to compare the susceptibility of biofilms of persistent strains of L. monocytogenes to the compounds benzalkonium chloride (BAC) and peracetic acid (PAA) and to a hydrogen peroxide/peracetic acid commercial disinfectant (P3-Oxonia). Twelve strains of L. monocytogenes, including nine BAC resistant and BAC sensitive persistent strains collected from the meat industry in Spain and three laboratory strains used as controls for BAC resistance, were used to compare the biofilm-forming ability and the disinfectant susceptibility of the strains. The assays tried to mimic food industry conditions. Consequently, biofilms were produced during 48 h at 25 ºC or during seven days at a refrigeration temperature (11 ºC), on stainless steel coupons (SSC), in dirty and clean biofilm-forming conditions, respectively in tryptone soy yeast extract broth (TSB-YE) and in nutrient-limiting, 1/10 diluted TSB-YE. Biofilms were evaluated by enumeration of viable cells on SSC. Concentration and contact time of the disinfectants were raised as needed to achieve the 4 Log reduction threshold in accordance with the European Standard EN 13697 2001. The results indicate that, in general, nutrient growth conditions and temperature had no significant effect (p>0.05) on biofilm formation. Biofilm growth conditions in TSB-YE/10 at 25 ºC and in TSB-YE at 11 ºC showed to be the ones where disinfection treatment with BAC, and particularly with P3, was more effective. Moreover, biofilms formed under nutritional stress (clean condition) tend to differentiate more their response to BAC, than biofilms grown in rich nutrient conditions (dirty condition). The concentrations and contact times of BAC required to achieve the 4 Log reduction threshold achieved 5120 mg/L for 5 min. Among the biofilms that showed the highest resistance to BAC, strains classified in planktonic as BAC resistant (MIC = 20 mg/L) and BAC sensitive (MIC = 1.25-5 mg/L) were included. Concentrations and contact times of PAA required to achieve the same 4 Log reduction threshold reached 2000 mg/L for 5 min, while all strains showed the same susceptibility to PAA in the planktonic state (MIC = 200 mg/L or 1600 mg/L depending on the method used). Concentrations and contact times of P3-Oxonia to achieve the 4 Log reduction threshold achieved the 2% (v/v) for 10 min. The results presented here emphasize the need for an efficient cleaning of equipment and utensils in the food industry especially those maintained at room temperature. The considerable difference between the referenced MICs of BAC and the concentrations required to achieve the 4 Log reduction in the biofilm form suggests that BAC is less effective than PAA in eliminating biofilm cells. PAA mode of action and its small molecular size constitute possible advantages for its efficiency. Overall, the resistant or sensitive character of planktonic L. monocytogenes cells to BAC did not dictate their response in biofilm form.
The contamination of food products with Listeria monocytogenes has been related to the presence of biofilms in the production lines, since biofilms can protect the cells from the action of sanitizers. The main goal of this work was to compare the susceptibility of biofilms of persistent strains of L. monocytogenes to the compounds benzalkonium chloride (BAC) and peracetic acid (PAA) and to a hydrogen peroxide/peracetic acid commercial disinfectant (P3-Oxonia). Twelve strains of L. monocytogenes, including nine BAC resistant and BAC sensitive persistent strains collected from the meat industry in Spain and three laboratory strains used as controls for BAC resistance, were used to compare the biofilm-forming ability and the disinfectant susceptibility of the strains. The assays tried to mimic food industry conditions. Consequently, biofilms were produced during 48 h at 25 ºC or during seven days at a refrigeration temperature (11 ºC), on stainless steel coupons (SSC), in dirty and clean biofilm-forming conditions, respectively in tryptone soy yeast extract broth (TSB-YE) and in nutrient-limiting, 1/10 diluted TSB-YE. Biofilms were evaluated by enumeration of viable cells on SSC. Concentration and contact time of the disinfectants were raised as needed to achieve the 4 Log reduction threshold in accordance with the European Standard EN 13697 2001. The results indicate that, in general, nutrient growth conditions and temperature had no significant effect (p>0.05) on biofilm formation. Biofilm growth conditions in TSB-YE/10 at 25 ºC and in TSB-YE at 11 ºC showed to be the ones where disinfection treatment with BAC, and particularly with P3, was more effective. Moreover, biofilms formed under nutritional stress (clean condition) tend to differentiate more their response to BAC, than biofilms grown in rich nutrient conditions (dirty condition). The concentrations and contact times of BAC required to achieve the 4 Log reduction threshold achieved 5120 mg/L for 5 min. Among the biofilms that showed the highest resistance to BAC, strains classified in planktonic as BAC resistant (MIC = 20 mg/L) and BAC sensitive (MIC = 1.25-5 mg/L) were included. Concentrations and contact times of PAA required to achieve the same 4 Log reduction threshold reached 2000 mg/L for 5 min, while all strains showed the same susceptibility to PAA in the planktonic state (MIC = 200 mg/L or 1600 mg/L depending on the method used). Concentrations and contact times of P3-Oxonia to achieve the 4 Log reduction threshold achieved the 2% (v/v) for 10 min. The results presented here emphasize the need for an efficient cleaning of equipment and utensils in the food industry especially those maintained at room temperature. The considerable difference between the referenced MICs of BAC and the concentrations required to achieve the 4 Log reduction in the biofilm form suggests that BAC is less effective than PAA in eliminating biofilm cells. PAA mode of action and its small molecular size constitute possible advantages for its efficiency. Overall, the resistant or sensitive character of planktonic L. monocytogenes cells to BAC did not dictate their response in biofilm form.
Descrição
Tese de mestrado em Microbiologia Aplicada, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2017
Palavras-chave
Biofilmes de Listeria monocytogenes Persistência Cloreto de benzalcónio (BAC) Ácido peracético (PAA) Desinfetante comercial P3-Oxonia Teses de mestrado - 2017