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Publicação
Genomic analysis and study of the antibiotic resistance profile of microorganisms associated with macroplastic biofilms found in Peniche
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Autores
Orientador(es)
Resumo(s)
A poluição por plásticos representa um dos problemas ambientais mais graves à escala global, devido à
sua persistência no ambiente e à capacidade de causar impactos físicos e químicos significativos. Estes
plásticos incluem microplásticos, provenientes da fragmentação de objetos maiores, e macroplásticos,
como sacos e embalagens, frequentemente descartados em áreas urbanas, industriais e agrícolas. A sua
acumulação no ambiente reflete falhas na gestão de resíduos e hábitos de consumo insustentáveis. Além
disso, os plásticos podem atuar como substrato para a colonização microbiana e para a posterior
disseminação de genes de resistência a antibióticos (ARGs) entre bactérias que habitam a plastisfera ou
o ambiente circundante, aumentando as preocupações relacionadas com a saúde humana, animal e
ambiental. O uso indiscriminado de antibióticos acelera a propagação de genes de resistência entre as
comunidades microbianas, um problema que afeta diretamente o equilíbrio ecológico e compromete a
saúde global. Um exemplo claro do impacto da resistência a antibióticos é o aumento de infeções
hospitalares causadas por microrganismos multirresistentes, que são mais difíceis e dispõe de um
tratamento mais dispendioso. Consequentemente, este fenómeno é agravado pela disseminação de
ARGs no ambiente, como na água utilizada para irrigação agrícola ou consumo humano. Sob a
perspetiva da abordagem "Uma Só Saúde", que integra as dimensões humanas, animais e ambientais,
torna-se evidente a necessidade de compreender a interação entre esses elementos e os impactos
resultantes. A resistência a antibióticos não é apenas uma questão de saúde pública, mas apresenta-se
também como um desafio ecológico e social. O uso inadequado de antibióticos em práticas médicas e
na agropecuária aumenta a pressão seletiva sobre as comunidades microbianas, favorecendo o
aparecimento de bactérias multirresistentes. Esses microrganismos, disseminam-se no ambiente e
podem contaminar a sistemas de água potável e alimentos, o que, por sua vez, pode ameaçar a saúde a
nível global. A mobilidade e disseminação desses genes é frequentemente facilitada através da
transferência horizontal, que pode ocorrer entre diferentes géneros bacterianos, agravando ainda mais a
situação e destacando a interconexão entre ecossistemas naturais e antrópicos. Diante esta situação, é
essencial investigar tanto a presença destes genes como a sua distribuição em os diversos ambientes,
particularmente em ecossistemas de transição, como rios, zonas estuarinas e praias. Estes locais
apresentam diversas influências ambientais e antropogénicas, tornando-se áreas de grande interesse para
o estudo de biofilmes microbianos associados a plásticos. Neste contexto, Peniche destaca-se como um
exemplo relevante. Ao longo dos anos, a cidade tornou-se um ponto estratégico para a economia
portuguesa devido à sua indústria pesqueira, ao crescente turismo e às praias valorizadas ao longo da
sua costa. Contudo, a foz do rio São Domingos, situada junto à Praia do Molhe Leste, evidencia os
impactos da atividade humana. A agricultura nas margens do rio tem levado à acumulação de resíduos
plásticos que acabam por chegar à praia, favorecendo a propagação de ARGs por meio da dispersão de
bactérias resistentes a antibióticos (ARB) em ambientes aquáticos e facilitando a transferência
horizontal de genes. Dado o aumento de relatos de bactérias multirresistentes em amostras ambientais
globais, torna-se urgente aprofundar o estudo dos ARGs em bactérias Gram-negativas associadas a estes
materiais. Assim, este estudo tem como objetivo investigar a presença de ARGs e a diversidade das
comunidades bacterianas associadas a macroplásticos nas áreas identificadas. Os objetivos incluem o
estudo e a avaliação de ARB em bactérias Gram-negativas (GNB), como a da família da
Enterobacteriaceae, encontradas em biofilmes de macroplásticos recolhidos no rio São Domingos, na
sua foz e na praia adjacente, a praia do Molhe Leste. Estes locais foram escolhidos visando a obtenção
de isolados de ambientes com diferentes níveis de salinidade e para examinar como os ARGs se podem
espalhar através destes locais distintos, influenciados por diferentes fontes de poluição e atividades
humanas. Adicionalmente, o estudo procura caracterizar os ARGs presentes nos isolados e avaliar o
potencial de mobilização dos plasmídeos encontrados através da transferência horizontal de genes por
transformação. Por último, pretende-se analisar a diversidade microbiológica associada aos plásticos e ao ambiente envolvente, incluindo areia e água, em cada local de amostragem, através da sequenciação
de DNA ambiental. Para o estudo, foram recolhidos plásticos nos vários locais. Em laboratório,
obtiveram-se suspensões de biofilme das superfícies dos macroplásticos. Após a inoculação, resultaram
143 isolados obtidos ao longo das três amostragens, em datas distintas. Após análise de perfis genéticos
por ERIC-PCR, esses isolados foram reduzidos a 122 isolados geneticamente distintos. Foram
amplificados oito ARGs putativos, e um integrão em oito isolados, incluindo blaCTX-M, blaTEM, blaNDM,
qnrS, intI1 e qnrD. No entanto, após sequenciação confirmou-se que três dos blaCTX-M foram
identificados como blaOXY e blaRAHN, enquanto a sequenciação amplificada como blaNDM foi confirmada
como sendo uma peptidase pertencente à família C40. Estes resultados enfatizam a necessidade de
confirmação através de sequenciação. A identificação taxonómica dos isolados positivos para ARGs
revelou géneros de bactérias com relevância clínica e ambiental, como Klebsiella sp., Aeromonas sp.,
Pseudomonas sp. e Proteus sp. Estes microrganismos são conhecidos pela sua capacidade de resistir a
múltiplos antibióticos, bem como pelo seu potencial de causar infeções em humanos e animais.
Para avaliar a mobilidade do plasmídeo, foi realizada uma transformação por choque térmico. Apenas o
gene qnrD1 do isolado FZ6 CIP N, foi possível transformar, evidenciando o seu potencial para
disseminação horizontal entre diferentes espécies bacterianas. O plasmídeo transformado foi
sequenciado por Next-Generation Sequencing (NGS). Este plasmídeo possuía 2682 pares de bases,
sendo associado a um tipo de replicão do plasmídeo Col3M. Além disso, uma análise genómica
comparativa revelou alta conservação do gene qnrD1 em diversas espécies bacterianas, sugerindo uma
ampla disseminação em ecossistemas naturais e antropizados. Além da deteção de ARGs, foi também
realizada uma análise de DNA ambiental e sequenciação através de NGS do gene 16S rDNA para
caracterização das comunidades bacterianas presentes em plásticos, água e areia nos locais de estudo.
Os resultados mostraram que o rio era o local que apresentava a maior diversidade microbiana,
influenciada pelo transporte de nutrientes e matéria orgânica provenientes de atividades agrícolas e
pecuárias. A zona da foz do rio aparenta ser uma área de transição, exibindo características microbianas
intermediárias entre as comunidades do rio e da praia. Por outro lado, as amostras de água apresentaram
uma maior diversidade em comparação com os plásticos e areia, possivelmente devido ao afluxo de
sedimentos transportados pela tempestade. Outra descoberta relevante foi a identificação de
comunidades bacterianas distintas em plásticos, água e areia, indicando que os plásticos poderão
abrigam comunidades microbiomas especializados que podem diferir significativamente das
comunidades microbianas das matrizes ambientais circundantes. Vários dos microrganismos detetados
em plásticos mostraram envolvimento em processos de degradação do material plástico, sugerindo que
esses ambientes podem servir como nichos para o desenvolvimento de capacidades metabólicas
específicas. Estes resultados destacam a importância do papel dos plásticos como reservatórios de ARGs
e comunidades microbianas, sublinhando a sua relevância tanto para a saúde pública como para a
integridade ecológica dos ecossistemas. A crescente presença de plásticos no ambiente e a sua interação
com microrganismos ressaltam a necessidade de esforços coordenados para a monitorização ecológica,
a gestão ambiental e intervenções em saúde pública. Como consequência, reforça-se a importância de
abordagens integradas no âmbito da "Uma Só Saúde", promovendo a colaboração interdisciplinar para
mitigar os impactos da poluição plástica e da disseminação de resistência a antibióticos e consideramse cruciais os esforços para compreender melhor o impacto da poluição plástica no desenvolvimento de
estratégias eficazes para a sua mitigação.
Plastic pollution is a major environmental problem on a global scale. Beyond the negative impacts of its persistence in the environment, plastics act as substrates for microbial colonization and the dissemination of antibiotic resistance genes (ARGs). This underscores the importance of investigating ARGs and the distribution and diversity of microbial communities in transitional ecosystems, such as rivers, estuarine zones, and adjacent beaches. This study investigated the presence of ARGs and bacterial diversity on plastic debris within these ecosystems. The focus was on assessing antibiotic-resistant bacteria (ARB) in macroplastic biofilms, determining ARGs and their potential mobilization by plasmids, and analysing microbiological diversity in plastics and surrounding environmental matrices. Biofilm suspensions from macroplastic surfaces yielded 143 bacterial isolates across three sampling events, later reduced to 122 distinct isolates via ERIC-PCR. Amplifications of eight isolates tested positive for ARGs, including blaOXY-M, blaTEM, blaRAHN, qnrS, intI1, and qnrD. Taxonomic identification revealed pathogenic genera like Klebsiella, Aeromonas, Pseudomonas, and Proteus. Plasmid extractions confirmed qnrD mobilizable resistance genes, particularly qnrD1, associated with a Col3M-type plasmid with 2682bp. Heat-shock transformation demonstrated qnrD1 plasmid dissemination potential, while comparative genomics revealed its high conservation across bacterial species. eDNA analysis and high-throughput sequencing of 16S rDNA gene amplicons characterised bacterial communities in plastic, water, and sand. The river showed the highest microbial diversity, influenced by agricultural and livestock inputs. The estuarine zone served as a transition area, and water samples exhibited greater diversity than plastics and sand due to storm-related sediment influx. These findings highlight the role of plastics as reservoirs of ARGs and microbial communities, reinforcing the need for ecological monitoring, targeted management, and public health interventions.
Plastic pollution is a major environmental problem on a global scale. Beyond the negative impacts of its persistence in the environment, plastics act as substrates for microbial colonization and the dissemination of antibiotic resistance genes (ARGs). This underscores the importance of investigating ARGs and the distribution and diversity of microbial communities in transitional ecosystems, such as rivers, estuarine zones, and adjacent beaches. This study investigated the presence of ARGs and bacterial diversity on plastic debris within these ecosystems. The focus was on assessing antibiotic-resistant bacteria (ARB) in macroplastic biofilms, determining ARGs and their potential mobilization by plasmids, and analysing microbiological diversity in plastics and surrounding environmental matrices. Biofilm suspensions from macroplastic surfaces yielded 143 bacterial isolates across three sampling events, later reduced to 122 distinct isolates via ERIC-PCR. Amplifications of eight isolates tested positive for ARGs, including blaOXY-M, blaTEM, blaRAHN, qnrS, intI1, and qnrD. Taxonomic identification revealed pathogenic genera like Klebsiella, Aeromonas, Pseudomonas, and Proteus. Plasmid extractions confirmed qnrD mobilizable resistance genes, particularly qnrD1, associated with a Col3M-type plasmid with 2682bp. Heat-shock transformation demonstrated qnrD1 plasmid dissemination potential, while comparative genomics revealed its high conservation across bacterial species. eDNA analysis and high-throughput sequencing of 16S rDNA gene amplicons characterised bacterial communities in plastic, water, and sand. The river showed the highest microbial diversity, influenced by agricultural and livestock inputs. The estuarine zone served as a transition area, and water samples exhibited greater diversity than plastics and sand due to storm-related sediment influx. These findings highlight the role of plastics as reservoirs of ARGs and microbial communities, reinforcing the need for ecological monitoring, targeted management, and public health interventions.
Descrição
Tese de Mestrado, Biologia Molecular e Genética, 2025, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências
Palavras-chave
Poluição Plástica eDNA Resistência a antibióticos Metabarcoding Ambientes transicionais Teses de mestrado - 2025