A carregar...
Publicação
Using cell culture of endemic freshwater fish to study the effects of temperature on plasticity
| Nome: | Descrição: | Tamanho: | Formato: | |
|---|---|---|---|---|
| 2.11 MB | Adobe PDF |
Autores
Orientador(es)
Resumo(s)
À medida que os efeitos das alterações climáticas se agravam, cada vez mais se torna impossível ignorar
as suas consequências ao estudar ambientes selvagens e as suas espécies endémicas, sobretudo quando
se trata de habitats de água doce. Os rios e os seus afluentes por todo o planeta representam um hotspot
de biodiversidade de todas as classes de organismos, incluindo peixes, muitas das quais estão
presentemente ameaçadas pelos efeitos de eventos como a subida de temperatura das águas, a destruição
de habitats, as invasões de espécies exóticas ou as secas. Assim, estas espécies de peixes tornam-se
vulneráveis a eventos de extinção, caso não consigam lidar com as alterações climáticas de modo a
manter as suas populações estáveis. Uma vez que migrar para ambientes mais favoráveis é muitas vezes
impossível, para contrariar este declínio e assegurar a sua sobrevivência e reprodução, os organismos
podem responder ativamente através de mecanismos de plasticidade fenotípica ou adaptar-se aos novos
ambientes (evolução). No entanto, as alterações no genoma de uma espécie, partindo de mutações e
respetiva ação de seleção natural de forma a levar à adaptação da mesma ao novo ambiente, é um
mecanismo que ocorre ao longo de várias gerações e que poderá não dar uma resposta suficientemente
rápida para contrariar o efeito de uma alteração ambiental repentina. Nesses casos, a plasticidade, ou
seja, a capacidade de produzir variados fenótipos a partir de um único genótipo, pode representar uma
alternativa que assegure que um determinado organismo consiga lidar com uma mudança no seu habitat.
Um exemplo de sistema adequado a estudar os efeitos da plasticidade fenotípica são as espécies de
peixes de água doce do género Squalius. Várias espécies pertencentes a este género habitam a Península
Ibérica, incluindo S. carolitertii no norte e S. pyrenaicus no centro. Apesar da atual distribuição destas
espécies não se sobrepor, sabe-se que espécies deste género hibridizam entre si, o que pode levar a
introgressão de genes de uma espécie para outra. As diversas populações de cada espécie estão sujeitas
aos efeitos de um gradiente latitudinal (norte-sul) no que toca ao tipo de habitat: os ambientes a norte
experienciam temperaturas mais baixas e ecossistemas mais estáveis, enquanto mais a sul as
temperaturas são mais altas e os ecossistemas mais instáveis e sujeitos a eventos extremos como secas.
Deste modo, é de esperar que os organismos que vivem em rios com temperatura e regimes intermitentes
distintos exibam variações no tipo de genes que expressam e na intensidade desta expressão.
Neste projeto, foram obtidos espécimes de três populações: S. carolitertii do norte (Rio Pego) e do
centro-norte (Rio Ceira), e S. pyrenaicus do centro (Rio Maior - Alcobertas). A partir da barbatana dorsal
destes animais, foram iniciadas culturas de linhas celulares de fibroblastos, que foram depois submetidas
a condições térmicas que simularam uma onda de calor: cinco dias a 32ºC, por oposição às condições
controlo a 20ºC. A realização deste trabalho usando linhas celulares em substituição dos organismos
vivos pretendia não só minimizar o sofrimento animal, mas também possibilitar submeter o mesmo
genoma a duas condições térmicas diferentes. Após o período experimental, foi extraído DNA e RNA
das células, para análises de Whole Genome Sequencing (WGS) e RNA-Seq, respetivamente, que
permitisse comparar genomas e transcriptomas não só entre regimes experimentais, mas também entre
populações.
Apesar de não ter sido encontrado um padrão significativo no que toca ao crescimento celular na
comparação deste parâmetro entre populações, a observação microscópica das células em cultura
permitiu detetar diferenças no número de grânulos de stress em volta do núcleo a 32ºC: existe uma maior
quantidade de grânulos nas células da população a norte, que decresce até à população a sul exibir apenas
um número negligenciável de grânulos.
Análises de WGS permitiram perceber que, genomicamente, a população de S. carolitertii que habita o
Rio Ceira é mais semelhante à população de S. pyrenaicus de Alcobertas do que à população de S.
carolitertii do Rio Pego, apesar de pertencerem a espécies diferentes. Este resultado é corroborado por
análises de coeficientes de ancestralidade individual, que demonstram que S. carolitertii do Ceira possui uma maior contribuição (~85%) semelhante à encontrada em Alcobertas, e apenas ~15% de contribuição
semelhante à outra população de S. carolitertii (Pego). Além disso, as duas populações de S. carolitertii
apresentam estimativas de diferenciação genómica superiores às encontradas entre S. carolitertii do
Ceira e S. pyrenaicus. A população do Ceira foi também a que demonstrou maiores valores de
heterozigosidade (diversidade genética).
A informação recolhida do transcriptoma das células permitiu comprovar o efeito da temperatura nos
genes expressos. Foram encontrados mais de mil genes expressos diferencialmente entre temperaturas
em todas as populações. No entanto, existem diferenças de expressão entre as três localizações,
mostrando que a influência da temperatura não é totalmente uniforme entre elas, nem entre os indivíduos
de cada uma. Todavia, um total de 56 genes foram diferencialmente expressos em todos os indivíduos
de todas as populações. A percentagem de genes e exões diferencialmente expressos foi semelhante em
todas as populações, apesar de S. carolitertii do Ceira apresentar mais genes diferencialmente expressos
únicos e também o maior número de genes sub-expressos. A análise das funções representadas pelos
genes diferencialmente expressos revelou que a função mais prevalente era de ligação (‘binding’),
indicando a importância de interações entre proteínas ou de proteínas com outros ligandos. Além disso,
foram encontradas funções em comum entre todas as populações, e entre Ceira e Pego, e Ceira e
Alcobertas, mas não entre Pego e Alcobertas. Foram ainda construídas quatro listas de proteínas
relacionadas com a temperatura, incluído listas de Heat-Shock Proteins (HSPs) e proteínas com elas
relacionadas, obtidas de outros trabalhos anteriores ou de informação disponibilizadas na Uniprot, cuja
informação foi cruzada com os genes diferencialmente expressos encontrados neste projeto. Todas as
populações expressaram uma diferente combinação de HSPs, sendo que as populações do Pego e
Alcobertas expressaram o maior número.
Os resultados obtidos na análise genómica deste trabalho apontam para a possibilidade da ocorrência de
um evento de introgressão passada entre as duas espécies em estudo, que terá originado a população do
Ceira. O facto de esta população ser também aquela que apresenta a mais elevada variabilidade genética
pode também ser resultado dessa introgressão. Este evento de introgressão de S. pyrenaicus em S.
carolitertii poderá influenciar não só os genomas dos organismos que existem no Rio Ceira, mas também
os seus transcriptomas. Apesar de todas as populações terem a sua expressão génica influenciada pelo
aumento de temperatura, empregando diversas combinações de HSPs e outras proteínas com funções
relacionadas com a manutenção da célula em condições de stress, a população do Ceira apresenta a
maior quantidade de genes sub-expressos. Isto poderá ser um sinal de que estes organismos investem
numa estratégia diferente no que toca a lidar com condições térmicas adversas: ao passo que as outras
populações sobre-expressam uma maior quantidade de HSPs, a população do Ceira poderá estar a usar
uma estratégia de poupança de energia, reduzindo a expressão proteica apenas às proteínas estritamente
necessárias, numa tentativa de poupar a maquinaria celular para outros processos e manter a célula em
funcionamento normal mesmo em condições de stress. A estratégia possivelmente usada pelas outras
duas populações parece ser mais bem sucedida em Alcobertas do que no Pego, uma vez que as células
em cultura desta última população apresentavam o número mais elevado de grânulos de stress, indicando
uma maior dificuldade destes organismos de lidar com aumentos de temperatura. Este resultado era
esperado, uma vez que este rio se situa a norte da Península Ibérica e experiencia temperaturas, em
média, mais reduzidas. A presença destes grânulos poderá ser explicada pela ausência de expressão da
proteína hspb9, que previne a acumulação de proteínas desnaturadas na célula. Esta proteína encontrouse sobre-expressa no Ceira e em Alcobertas, sendo que os indivíduos destas populações apresentavam
um número mais reduzido de grânulos. Além disso, sabe-se que a presença excessiva de HSPs na célula
pode causar a deposição e agregação de proteínas in vitro. O presente trabalho não só demonstra a praticabilidade da utilização de cultura de células de peixes para
estudos de transcriptoma, como também confirma que a temperatura tem efeitos significativos nas
células de um organismo, obrigando a que estes ponham em prática estratégias de regulação térmica de
modo a assegurar a sobrevivência da célula e a estabilidade das suas proteínas. No entanto, esta
plasticidade poderá não ser suficiente para lidar com as alterações climáticas caso as temperaturas
continuem a subir na natureza. As combinações de proteínas expressas nas várias populações poderá ter
origem na possível passada introgressão que terá formado a população do Rio Ceira, e que terá fornecido
a estes indivíduos combinações favoráveis de genes que lhes permitem combater as altas temperaturas.
No entanto, mais estudos teriam de ser realizados tanto para caracterizar a introgressão na população do
Ceira como para melhor compreender o tipo de proteínas presentes nos grânulos de stress e a função da
plasticidade na resposta ao stress térmico.
Freshwater environments are particularly vulnerable to increasing temperatures caused by climate change, and to increasing severity of extreme climate events. Organisms can respond to such environmental changes by regulating their physiology and metabolism, by changing the expression of certain genes. It is thus expected that these changes will cause fish to display differences in their transcriptome. For this project, we used two Iberian chub species, Squalius carolitertii and Squalius pyrenaicus, and subjected them to heat stress to compare gene expression between populations from different thermal environments: S. carolitertii from the Pego basin in the north, S. pyrenaicus from the Tagus basin in the south, and S. carolitertii from the Mondego basin in the centre. Previous genetic studies suggested that the S. carolitertii population from Mondego could be admixed with contributions from S. pyrenaicus. We obtained whole genome data from three individuals from each population, together with gene expression at 20⁰C and 32⁰C from cell cultures derived from the fin clips of these individuals, exposing cells from the same individual to the two temperatures. Genomic data indicated that the Mondego S. carolitertii population was admixed, and genetically closer to the southern S. pyrenaicus. The Mondego population also displayed the highest values of heterozygosity, in agreement with past hybridization and gene flow from S. pyrenaicus into that S. carolitertii population. We found over 1000 genes differentially expressed between temperatures on all populations, with the admixed population displaying the highest number, suggesting that admixed individuals have a more plastic response. We discovered almost twenty candidate heat shock proteins (HSPs) differentially expressed in all populations. The admixed population was the one with less upregulated HSPs despite its high number of differentially expressed genes. Our results support the hypothesis that admixed individuals' transcriptomes differ from the parental species, especially when faced with thermally harsh conditions.
Freshwater environments are particularly vulnerable to increasing temperatures caused by climate change, and to increasing severity of extreme climate events. Organisms can respond to such environmental changes by regulating their physiology and metabolism, by changing the expression of certain genes. It is thus expected that these changes will cause fish to display differences in their transcriptome. For this project, we used two Iberian chub species, Squalius carolitertii and Squalius pyrenaicus, and subjected them to heat stress to compare gene expression between populations from different thermal environments: S. carolitertii from the Pego basin in the north, S. pyrenaicus from the Tagus basin in the south, and S. carolitertii from the Mondego basin in the centre. Previous genetic studies suggested that the S. carolitertii population from Mondego could be admixed with contributions from S. pyrenaicus. We obtained whole genome data from three individuals from each population, together with gene expression at 20⁰C and 32⁰C from cell cultures derived from the fin clips of these individuals, exposing cells from the same individual to the two temperatures. Genomic data indicated that the Mondego S. carolitertii population was admixed, and genetically closer to the southern S. pyrenaicus. The Mondego population also displayed the highest values of heterozygosity, in agreement with past hybridization and gene flow from S. pyrenaicus into that S. carolitertii population. We found over 1000 genes differentially expressed between temperatures on all populations, with the admixed population displaying the highest number, suggesting that admixed individuals have a more plastic response. We discovered almost twenty candidate heat shock proteins (HSPs) differentially expressed in all populations. The admixed population was the one with less upregulated HSPs despite its high number of differentially expressed genes. Our results support the hypothesis that admixed individuals' transcriptomes differ from the parental species, especially when faced with thermally harsh conditions.
Descrição
Tese de Mestrado, Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento, 2025, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências
Palavras-chave
Squalius Plasticidade Expressão génica Temperatura Hibridação Teses de mestrado - 2025