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Peptidoglycan hydrolases : sub-cellular localization of pneumococcal LytA and LytB
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Resumo(s)
S. pneumoniae is a Gram-positive cocci bacterium that colonizes the human nasopharynx asymptomatically. However, the increase of the bacterial burden in the organism and the dissemination to other host tissues can lead to a state of disease. Pneumococcal caused diseases can range from mild ear and sinus infections to more severe like pneumonia and meningitis, turning pneumococcus a priority pathogen as defined by the World Health Organization.
The bacterial surface plays a critical role in the process of how bacteria interact with the infected host. The pneumococcal cell is surrounded by a glycopolymer, named as capsule (CPS), which is essential to bacterial colonization and invasion. Beneath this layer lies another large polymer, the peptidoglycan (PGN), which is composed by glycan chains cross-linked by short peptides that can trigger an immune response when detected by the infected host.
Pneumococcus has different mechanisms to avoid PGN recognition by receptors present at the surrounding medium, which may modulate its virulence. The CPS and wall teichoic acids, besides their well-documented physiological functions, may hide the PGN from the host by restraining the accessibility of receptors to this polymer. This bacterial camouflage system can be optimized by the production of particular PGN hydrolases that trim the outside fragments of PGN. These pneumococcal PGN hydrolases also have other reported functions: the triggering of the major autolysin LytA activity induces lysis in the stationary phase, the non-autolytic hydrolase LytB is required and has a major role in the separation of the two daughter cells. The organization of LytA and LytB is similar: both have a choline binding domain (CBD) that attaches the protein to the cell wall and a catalytic module.
In this study, we aimed to explore the subcellular localization of the PGN hydrolases LytA and LytB to better understand how they might modulate the composition of the pneumococcal surface. We specifically addressed if the binding to the PGN of each hydrolase is affected by the presence of the other. Moreover, we also studied if their attachment is affected by the external CPS.
We first purified fluorescent derivatives of the LytA and LytB proteins that were then incubated, separately and in combination, with four different S. pneumoniae strains: the wild-type encapsulated ATCC6314 strain, its Δcps mutant (that is unable to produce any capsule due to the absence of the entire capsule operon), its Δwzd and Δwze mutants (that lack the genes that encode the Wzd/Wze proteins that regulate the synthesis of the capsule). The ability of the fluorescent PGN hydrolases to attach the surface of the different bacterial strains were analysed by fluorescence microscopy.
We found that the LytA binding patterns were mostly characterized by binding of the LytA hydrolase to the cell septum and poles. Binding to the bacterial poles increased when LytA was added to a bacterial suspension in the presence of LytB.
The LytB binding patterns were mostly characterized by the presence of protein bound to the septum. In the presence of LytA, the binding of LytB to the surface of bacteria remained largely unchanged, with differences only in Δwzd and Δwze, in which LytB seemed to localize preferably to the poles. These observations suggest that binding of LytB to the surface of bacteria, in this case the poles, is prevented by the presence of capsule at these subcellular regions of the bacterial cell surface.
The results presented here suggest that LytA and LytB seem to bind preferably to different regions of the pneumococcal cell surface and that binding of LytA to the pneumococcal surface can be influenced by LytB. These observations may be explained by the larger size of the CBD module present in the LytB PGN hydrolase, supporting its critical function and substrate specificity at the septum. Revealing the localization of the PGN hydrolases, specifically of LytA and LytB, will allow understanding better their role in regulating the pneumococcal interaction with the host.
S.pneumoniae é uma bactéria Gram-positiva que coloniza a nasofaringe humana de forma assintomática. No entanto, o aumento da carga bacteriana no organismo e a sua disseminação para outros tecidos podem levar à disbiose e, consequentemente, a um estado de doença. As diferentes doenças causadas por pneumococos podem variar desde infeções leves, como a otite ou sinusite, a mais graves como pneumonia e meningite, que justifica a identificação de pneumococos como patógenos bacterianos prioritários pela Organização Mundial da Saúde. A superfície bacteriana desempenha um papel crítico no modo como as bactérias interagem com o organismo hospedeiro. A bactéria de pneumococos é circundada pela cápsula (CPS), um polímero essencial para a colonização e invasão bacteriana. Sob essa camada está o peptidoglicano (PGN), um outro polímero bacteriano que é composto por cadeias de glicano ligadas entre si por pequenos péptidos que, se detetados pelo hospedeiro, são capazes de desencadear uma resposta do sistema imunitário do organismo infetado. O pneumococo desenvolveu mecanismos para evitar o reconhecimento de PGN e modelar a sua virulência. A CPS e os ácidos teicóicos da parede, além das suas funções fisiológicas, também escondem o PGN restringindo assim o seu acesso. Este sistema de camuflagem por ser otimizado pela produção de hidrolases de PGN capazes de cortar os fragmentos externos de PGN. Estas hidrolases têm também outras funções: a ativação da atividade da principal autolisina LytA, é capaz de induzir a lise das bactérias numa fase estacionária do crescimento, a presença da hidrolase não autolítica LytB é necessária, e desempenha um papel importante, para a separação das duas células filhas após a divisão bacteriana. A organização das enzimas LytA e LytB é semelhante: ambas têm um domínio de ligação à colina (CBD) que liga a proteína à parede celular e um domínio catalítico. Neste estudo, objetivamos determinar a localização subcelular das hidrolases LytA e LytB de modo a entender melhor como podem afetar a superfície pneumocócica. Abordamos também se a ligação ao PGN de cada hidrolase é afetada pela presença da outra e se estas são afetadas pela presença de CPS. Primeiro purificámos derivados fluorescentes das proteínas LytA e LytB que depois foram incubados, separadamente e em conjunto, com bactérias de quatro estirpes diferentes de S.pneumoniae: a estirpe parental capsulada ATCC6314, o seu mutante Δcps (que não produz cápsula por se ter removido o operão cps), os mutantes Δwzd e Δwze (que não têm os genes que codificam as proteínas Wzd/Wze importantes para a regulação da síntese da cápsula). A capacidade dos derivados fluorescente das PGN hidolases em ligar a superfície bacteriana produzida pelos diferentes mutantes foi então analisada por microscopia de fluorescência. Descobrimos que os fenótipos de ligação da LytA são principalmente caracterizados por uma ligação ao septo e aos polos das bactérias. A ligação aos pólos das bactérias aumentou quando a hidrólase LytA foi adicionada a uma suspensão bacteriana na presença de LytB. Os fenótipos de ligação do LytB foram principalmente caracterizados pela presença de uma ligação ao septo. A presença de LytA na suspensão não alterou a ligação de LytB nas estirpes parental e mutante ATCCΔcps. Apenas nas estirpes ATCCΔwzd e ATCCΔwze, foi possível observar uma melhor localização polar da enzima LytB com a adição de LytA. Os fenótipos observados nestas estirpes comparando com os observados nas estirpes wild-type e ATCCΔcps sugerem que a LytB se liga mais facilmente a zonas não capsuladas existentes nos pólos das bactérias ATCCΔwzd e ATCCΔwze. Os resultados apresentados demonstram que a ligação da enzima LytA à superfície pneumocócica é influenciada pela presença da hidrolase de peptidoglicano LytB. Isso pode ser explicado pelo maior tamanho do módulo de ligação da enzima LytB, e pelo maior número de CBD neste módulo, o que suportaria uma função específica e crítica no septo. A determinação da localização das hidrolases de PGN, especificamente LytA e LytB, permitirá entender melhor o seu papel na regulação da interação do pneumococo com o hospedeiro.
S.pneumoniae é uma bactéria Gram-positiva que coloniza a nasofaringe humana de forma assintomática. No entanto, o aumento da carga bacteriana no organismo e a sua disseminação para outros tecidos podem levar à disbiose e, consequentemente, a um estado de doença. As diferentes doenças causadas por pneumococos podem variar desde infeções leves, como a otite ou sinusite, a mais graves como pneumonia e meningite, que justifica a identificação de pneumococos como patógenos bacterianos prioritários pela Organização Mundial da Saúde. A superfície bacteriana desempenha um papel crítico no modo como as bactérias interagem com o organismo hospedeiro. A bactéria de pneumococos é circundada pela cápsula (CPS), um polímero essencial para a colonização e invasão bacteriana. Sob essa camada está o peptidoglicano (PGN), um outro polímero bacteriano que é composto por cadeias de glicano ligadas entre si por pequenos péptidos que, se detetados pelo hospedeiro, são capazes de desencadear uma resposta do sistema imunitário do organismo infetado. O pneumococo desenvolveu mecanismos para evitar o reconhecimento de PGN e modelar a sua virulência. A CPS e os ácidos teicóicos da parede, além das suas funções fisiológicas, também escondem o PGN restringindo assim o seu acesso. Este sistema de camuflagem por ser otimizado pela produção de hidrolases de PGN capazes de cortar os fragmentos externos de PGN. Estas hidrolases têm também outras funções: a ativação da atividade da principal autolisina LytA, é capaz de induzir a lise das bactérias numa fase estacionária do crescimento, a presença da hidrolase não autolítica LytB é necessária, e desempenha um papel importante, para a separação das duas células filhas após a divisão bacteriana. A organização das enzimas LytA e LytB é semelhante: ambas têm um domínio de ligação à colina (CBD) que liga a proteína à parede celular e um domínio catalítico. Neste estudo, objetivamos determinar a localização subcelular das hidrolases LytA e LytB de modo a entender melhor como podem afetar a superfície pneumocócica. Abordamos também se a ligação ao PGN de cada hidrolase é afetada pela presença da outra e se estas são afetadas pela presença de CPS. Primeiro purificámos derivados fluorescentes das proteínas LytA e LytB que depois foram incubados, separadamente e em conjunto, com bactérias de quatro estirpes diferentes de S.pneumoniae: a estirpe parental capsulada ATCC6314, o seu mutante Δcps (que não produz cápsula por se ter removido o operão cps), os mutantes Δwzd e Δwze (que não têm os genes que codificam as proteínas Wzd/Wze importantes para a regulação da síntese da cápsula). A capacidade dos derivados fluorescente das PGN hidolases em ligar a superfície bacteriana produzida pelos diferentes mutantes foi então analisada por microscopia de fluorescência. Descobrimos que os fenótipos de ligação da LytA são principalmente caracterizados por uma ligação ao septo e aos polos das bactérias. A ligação aos pólos das bactérias aumentou quando a hidrólase LytA foi adicionada a uma suspensão bacteriana na presença de LytB. Os fenótipos de ligação do LytB foram principalmente caracterizados pela presença de uma ligação ao septo. A presença de LytA na suspensão não alterou a ligação de LytB nas estirpes parental e mutante ATCCΔcps. Apenas nas estirpes ATCCΔwzd e ATCCΔwze, foi possível observar uma melhor localização polar da enzima LytB com a adição de LytA. Os fenótipos observados nestas estirpes comparando com os observados nas estirpes wild-type e ATCCΔcps sugerem que a LytB se liga mais facilmente a zonas não capsuladas existentes nos pólos das bactérias ATCCΔwzd e ATCCΔwze. Os resultados apresentados demonstram que a ligação da enzima LytA à superfície pneumocócica é influenciada pela presença da hidrolase de peptidoglicano LytB. Isso pode ser explicado pelo maior tamanho do módulo de ligação da enzima LytB, e pelo maior número de CBD neste módulo, o que suportaria uma função específica e crítica no septo. A determinação da localização das hidrolases de PGN, especificamente LytA e LytB, permitirá entender melhor o seu papel na regulação da interação do pneumococo com o hospedeiro.
Descrição
Tese de mestrado, Microbiologia Clínica e Doenças Infeciosas Emergentes, Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2020
Palavras-chave
Streptococcus pneumoniae Peptidoglycan hydrolases Cell wall binding LytB LytA Teses de mestrado - 2020