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Publicação
Construction of glucocorticoid receptor minigene to study alternative splicing mechanism : the role of dehydroepiandrosterone on the receptor for activated C kinase-1 expression
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Resumo(s)
Os glucocorticóides são um grupo farmacoterapêutico bastante utilizado no tratamento de diversas patologias inflamatórias agudas e crónicas, incluindo alergias graves e doenças do foro dermatológico, asma, patologias auto-imunes, transplante de órgãos e alguns tipos de cancro. É frequente o desenvolvimento de resistência à terapêutica com glucocorticóides após a sua administração durante longos períodos de tempo e, principalmente, como consequência do declínio na eficácia da resposta imunológica com o avanço da idade, um processo denominado imunosenescência. Compreender os mecanismos moleculares que podem estar na origem da resistência aos glucocorticóides proporciona o desenvolvimento de novos tratamentos que podem melhorar os regimes da corticoterapia.
Com o desenvolvimento da imunosenescência, alterações na via de transdução de sinal da proteína cinase C, muito relevante no sucesso da resposta imunitária, têm vindo a ser reconhecidas. Nos últimos anos, tem vindo a ser amplamente estudado o mecanismo de ação dos glucocorticóides no receptor activado para a cinase C1, que tem um papel relevante em muitas vias imunológicas, bem como no processo da patologia oncológica. Caracterizou-se a região do promotor humano de RACK-1 identificando-se o elemento de resposta ao glucocorticóide. Após ter sido demonstrado que o cortisol tem a capacidade de regular negativamente a expressão de RACK-1 através da sua ação sobre o receptor glucocorticóide; verificou-se que a exposição prolongada a DHEA poderá contrariar este efeito restaurando assim os níveis da proteína RACK-1 e a produção de citocinas. Em particular, DHEA modula o efeito do cortisol na expressão de RACK-1 através da sua interferência particular no processo de splicing aquando da síntese do receptor glucocorticóide. Verifica-se também que o tratamento com DHEA induz um aumento da regulação da isoforma GRβ dose-dependente, sem afetar a expressão da isoforma GRα. Há um aumento significativo da razão GRβ/GRα nas células pré-tratadas com DHEA e, posteriormente, com cortisol, quando em comparação com as células tratadas apenas com cortisol.
É importante a compreensão da via de transdução de sinal PKC/RACK-1 no contexto da imunosenescência e o estudo do mecanismo de splicing alternativo do receptor glucocorticóide. Este projeto pretende contribuir para uma melhor compreensão do mecanismo de ação de DHEA e do seu efeito anti-glucocorticóide sobre o sistema imunitário. Considerando que DHEA influencia a expressão de alguns factores de proteínas de splicing, os principais reguladores do splicing alternativo do GR, o principal objetivo do projeto é esclarecer o efeito de DHEA, através da construção do minigene representativo de GR. É também considerada a validação da construção do minigene como uma tecnologia efetiva para o estudo deste mecanismo molecular no âmbito da farmacologia aplicada.
Glucocorticoids are widely used in a number of acute and chronic inflammatory conditions, including severe allergies and skin problems, asthma, autoimmune diseases, organ transplantation and some types of cancer. People often develop steroid resistance after prolonged high doses of corticosteroid therapy and when there is a decrease in the efficacy of immunity response with ageing, a process named immunosenescence. Understanding the mechanisms behind glucocorticoids resistance will lead to novel treatments that may improve and refine treatment regimens. In the past years knowledge concerning the details of glucocorticoid action on a peculiar target and the receptor for activated C kinase 1, which is a player in many immunological pathways as well as in cancer biology, has been developed. We characterized the human RACK-1 promoter region identifying a glucocorticoid responsive element. We demonstrated that cortisol is able to downregulate RACK-1 expression via glucocorticoid receptor. However, prolonged dehydroepiandrosterone exposure counteracted this effect restoring RACK-1 levels and cytokine production. In particular, DHEA modulates the effect of cortisol on RACK-1 expression interfering on the splicing of the glucocorticoid receptor. We demonstrated that DHEA treatment induced a dose-dependent up-regulation of glucocorticoid receptor isoform β without affecting the expression of glucocorticoid receptor isoform α. Finally, a significant increase in the GRβ/GRα ratio was observed with DHEA pre-treatment respect to cells treated only with cortisol. Is important the clarification of the role of PKC/RACK-1 signalling in immunosenescence context and the study of the alternative splicing mechanism of glucocorticoid receptor. This project intends to contribute for a better comprehension of the action mechanism of DHEA and its effect on the immune system as an anti-glucocorticoid agent. Considering that DHEA influence the expression of some splicing factor proteins, the main regulators of the alternative splicing of the GR, the main goal of this project is to explain this DHEA effect using the minigene construct representing GR. Additionally, this project intends to validate this minigene construct as an effective technology to study this molecular mechanism in the context of applied pharmacology.
Glucocorticoids are widely used in a number of acute and chronic inflammatory conditions, including severe allergies and skin problems, asthma, autoimmune diseases, organ transplantation and some types of cancer. People often develop steroid resistance after prolonged high doses of corticosteroid therapy and when there is a decrease in the efficacy of immunity response with ageing, a process named immunosenescence. Understanding the mechanisms behind glucocorticoids resistance will lead to novel treatments that may improve and refine treatment regimens. In the past years knowledge concerning the details of glucocorticoid action on a peculiar target and the receptor for activated C kinase 1, which is a player in many immunological pathways as well as in cancer biology, has been developed. We characterized the human RACK-1 promoter region identifying a glucocorticoid responsive element. We demonstrated that cortisol is able to downregulate RACK-1 expression via glucocorticoid receptor. However, prolonged dehydroepiandrosterone exposure counteracted this effect restoring RACK-1 levels and cytokine production. In particular, DHEA modulates the effect of cortisol on RACK-1 expression interfering on the splicing of the glucocorticoid receptor. We demonstrated that DHEA treatment induced a dose-dependent up-regulation of glucocorticoid receptor isoform β without affecting the expression of glucocorticoid receptor isoform α. Finally, a significant increase in the GRβ/GRα ratio was observed with DHEA pre-treatment respect to cells treated only with cortisol. Is important the clarification of the role of PKC/RACK-1 signalling in immunosenescence context and the study of the alternative splicing mechanism of glucocorticoid receptor. This project intends to contribute for a better comprehension of the action mechanism of DHEA and its effect on the immune system as an anti-glucocorticoid agent. Considering that DHEA influence the expression of some splicing factor proteins, the main regulators of the alternative splicing of the GR, the main goal of this project is to explain this DHEA effect using the minigene construct representing GR. Additionally, this project intends to validate this minigene construct as an effective technology to study this molecular mechanism in the context of applied pharmacology.
Descrição
Trabalho Final de Mestrado Integrado, Ciências Farmacêuticas, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2016
Palavras-chave
Imunosenescência Terapêutica glucocorticóide Mecanismo de splicing alternativo Receptor glucocorticóide β Desidroepiandrosterona Expressão de RACK-1 Mestrado Integrado - 2016