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Publicação
Epigenetic modifications in the offspring after spermatogonial stem cell transplantation
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Orientador(es)
Resumo(s)
Background: Mouse spermatogonial stem cell transplantation (SSCT) has become an established research model to study the testicular germ cell line. By performing SSCT in mice, donor spermatogenesis can be re-established in the seminiferous tubules of an otherwise infertile recipient. Transplanted males are able to produce fertile offspring after spontaneous mating. Therefore, SSCT is a promising fertility preservation technique for prepubertal boys who are exposed to gonadotoxic treatments, leading to infertility. Compared to the increasing reports illustrating the effectiveness of SSCT in reproductive terms, only a few studies addressed safety issues. Before accepting SSCT as a clinical strategy, all potential safety concerns need to be carefully evaluated. In the present project we investigated whether epigenetic modifications occur in the correct way during early embryogenesis and during spermatogenesis in offspring. Material & Methods: We evaluated the general methylation level, using immunohistochemistry for 5-methylcytosin (5-MC), in pre-implantation embryos of different stages (2-cell, 4-cell, multi-cell, morula and blastocyst) from GFP- transplanted mice with GFP+ testicular donor cells. We also analyzed the acetylation of H4K8. Stainings for 5-MC, DNMT3a, H4K5ac and H4K8ac were also performed on testicular tissue from live born GFP+ male offspring of transplanted mice. Results: Unfortunately, no GFP+ embryos could be obtained from the transplanted males. The GFP+ offspring showed a correct pattern for H4K5ac and H4K8ac in the spermatids, but some abnormalities were seen in the spermatocytes. No major differences were indicated for DNMT3a and 5-MC compared to fertile adult controls. Conclusion: No major abnormalities on epigenetic level were observed, and the ones observed do not seem to cause anything severe. Anyway, it is still necessary to repeat the embryo experiment to check possible epigenetic problems during embryo development. Therefore, even though SSCT has potential as a clinical application, more research is required before becoming a fertility preservation technique.
Quinze anos após a sua introdução, o transplante de células espermatogoniais estaminais (SSCT) no rato tornou-se um modelo de investigação estabelecido para o estudo e manipulação da linhagem germinativa das células testiculares. Através do SSCT em ratos, a espermatogénese de um dador é reestabelecida nos túbulos seminíferos de um receptor infértil. Machos transplantados são capazes de produzir descendência após acasalamento espontâneo, e também foi demonstrada fertilidade nos descendentes. Portanto SSCT é uma técnica promissora para a preservação da fertilidade de rapazes que ainda não atingiram a puberdade e que são expostos a tratamentos gonadotóxicos que provocaram uma eventual infertilidade. No entanto, apesar das evidências que ilustram a eficácia do SSCT em termos reprodutivos, apenas alguns estudos abordam questões de segurança ao nível de modificações da linha germinativa, como, por exemplo, aberrações cromossómicas, alterações no imprinting e modificações epigenéticas. Por isso, antes do SSCT ser aceite como estratégia clínica, todos os potenciais problemas devem ser verificados e avaliados. Neste projecto, vamos investigar se algumas modificações epigenéticas ocorrem ou não de forma correcta durante a embriogénese e durante a espermatogénese dos descendentes de ratos transplantados. Foi avaliado o nível de metilação geral, fazendo himuno-histoquímica para o 5-metilcitosina (5-MC), em embriões de diferentes estádios de desenvolvimento embrionário (2-células, 4-células, multi-células, morula e blastocisto) de ratos GFP- transplantados com células testiculares de uma dador GFP+. Também foi avaliada a aceptilação da H4K8. Colorações para 5-MC, DNMT3a, H4K5ac e H4K8ac foram realizadas em tecido testicular de descendência GFP+ nascida dos ratos transplantados. Infelizmente não se conseguiram obter embriões GFP+ a partir dos machos transplantados. A prole GFP+ nascida mostrou um padrão correto para a aceptilação da H4K5 e da H4K8 nos espermatídios, mas algumas alterações foram observadas nos espermatócitos. Não foram detectadas grandes diferenças para o DNMT3a e a 5-MC em relação aos controlos adultos férteis. Ou seja, não foram observadas grandes alterações ao nível epigenético, e as observadas parecem não causar nada de grave. De qualquer forma, ainda é necessário repetir a experiência ao nível do desenvolvimento embrionário para se verificar possíveis problemas epigenéticos durante o desenvolvimento do embrião. Portanto, embora SSCT tenha um grande potencial para a aplicação clínica, é necessária mais investigação antes de se tornar uma técnica de preservação da fertilidade.
Quinze anos após a sua introdução, o transplante de células espermatogoniais estaminais (SSCT) no rato tornou-se um modelo de investigação estabelecido para o estudo e manipulação da linhagem germinativa das células testiculares. Através do SSCT em ratos, a espermatogénese de um dador é reestabelecida nos túbulos seminíferos de um receptor infértil. Machos transplantados são capazes de produzir descendência após acasalamento espontâneo, e também foi demonstrada fertilidade nos descendentes. Portanto SSCT é uma técnica promissora para a preservação da fertilidade de rapazes que ainda não atingiram a puberdade e que são expostos a tratamentos gonadotóxicos que provocaram uma eventual infertilidade. No entanto, apesar das evidências que ilustram a eficácia do SSCT em termos reprodutivos, apenas alguns estudos abordam questões de segurança ao nível de modificações da linha germinativa, como, por exemplo, aberrações cromossómicas, alterações no imprinting e modificações epigenéticas. Por isso, antes do SSCT ser aceite como estratégia clínica, todos os potenciais problemas devem ser verificados e avaliados. Neste projecto, vamos investigar se algumas modificações epigenéticas ocorrem ou não de forma correcta durante a embriogénese e durante a espermatogénese dos descendentes de ratos transplantados. Foi avaliado o nível de metilação geral, fazendo himuno-histoquímica para o 5-metilcitosina (5-MC), em embriões de diferentes estádios de desenvolvimento embrionário (2-células, 4-células, multi-células, morula e blastocisto) de ratos GFP- transplantados com células testiculares de uma dador GFP+. Também foi avaliada a aceptilação da H4K8. Colorações para 5-MC, DNMT3a, H4K5ac e H4K8ac foram realizadas em tecido testicular de descendência GFP+ nascida dos ratos transplantados. Infelizmente não se conseguiram obter embriões GFP+ a partir dos machos transplantados. A prole GFP+ nascida mostrou um padrão correto para a aceptilação da H4K5 e da H4K8 nos espermatídios, mas algumas alterações foram observadas nos espermatócitos. Não foram detectadas grandes diferenças para o DNMT3a e a 5-MC em relação aos controlos adultos férteis. Ou seja, não foram observadas grandes alterações ao nível epigenético, e as observadas parecem não causar nada de grave. De qualquer forma, ainda é necessário repetir a experiência ao nível do desenvolvimento embrionário para se verificar possíveis problemas epigenéticos durante o desenvolvimento do embrião. Portanto, embora SSCT tenha um grande potencial para a aplicação clínica, é necessária mais investigação antes de se tornar uma técnica de preservação da fertilidade.
Descrição
Tese de mestrado. Biologia (Biologia Humana e Ambiente). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2013
Palavras-chave
Células estaminais Espermatogénese Fertilidade Teses de mestrado - 2013