Hit optimization to improve aqueous solubility of compounds with antimycobacterial activity

Freitas, Elisabete Cristina Silva

http://hdl.handle.net/10451/54022

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Authors

Freitas, Elisabete Cristina Silva

Advisor(s)

Lopes, Francisca da Conceição

Harjivan, Shrika

Abstract(s)

A tuberculose (TB) é uma doença infeciosa causada pelo Mycobacterium tuberculosis (Mtb) e é considerada uma das 10 principais causas de morte a nível mundial e a principal devida a um único agente. Em 2018 foram reportados 10 milhões de novos casos e 1,5 milhões de mortes. É considerada um perigo para a saúde pública devido ao contínuo aparecimento de novos casos, bem como ao crescimento da resistência antimicrobiana associada aos fármacos atualmente disponíveis. Em pacientes infetados com HIV (Vírus da Imunodeficiência Adquirida), a TB representa a principal causa de morte, sendo a probabilidade de desenvolverem a doença 19 vezes superior quando comparados com pacientes não infetados com HIV. A Organização Mundial da Saúde estima que cerca de 23% da população (1,7 mil milhões de pessoas) tem TB latente. Esta forma da patologia observa-se quando o sistema imunitário é capaz de controlar a propagação do Mtb. Contudo, não apresenta sintomas, o que torna difícil a sua deteção e, caso o sistema imunitário do hospedeiro seja comprometido, pode levar a uma reativação causando, consequentemente, TB ativa. Portanto, pessoas com TB latente representam uma fonte de contaminação e propagação da doença. Fatores como a ausência de uma vacina totalmente eficaz, a longa duração dos tratamentos e o lento desenvolvimento de novos medicamentos, torna difícil a erradicação da TB. O mecanismo de infeção começa com a inalação dos bacilos que, dada a sua reduzida dimensão, conseguem chegar aos alvéolos pulmonares. Seguidamente são fagocitados por macrófagos que têm a capacidade de recrutar outras células imunológicas para o local da infeção. Este recrutamento levará à formação de uma estrutura que impedirá a propagação dos bacilos, denominada granuloma. Esta é tão favorável para o bacilo quanto para o hospedeiro, uma vez que, se por um lado o granuloma impede que o Mtb se espalhe (causando lesões nos pulmões e outros órgãos), por outro lado, o Mtb dentro do granuloma consegue sobreviver, apesar de se encontrar num estado não-replicativo. Na maioria dos casos, o granuloma é suficiente para conter o bacilo, contudo, aquando de um enfraquecimento do sistema imunitário do hospedeiro, o Mtb pode ser libertado e levar ao desenvolvimento de TB ativa. O precoce diagnóstico e correto tratamento são as principais ferramentas para o controlo da doença. A deteção da TB latente pode ser feita in vivo, através do teste da tuberculina complementado com Raios-X ao tórax e análise da expetoração, ou in vitro, pelo ensaio de libertação de interferon-gama. De maneira a providenciar a terapia mais adequada, é realizado um teste de suscetibilidade aos fármacos, possibilitando a deteção de resistências. As várias resistências contra os fármacos atualmente disponíveis constituem um grande perigo na luta contra a TB. Atualmente, estão descritos quatro tipos de resistência, TB resistente à rifampicina; TB multi-resistente, quando resistente pelo menos à isoniazida e rifampicina; TB extensivamente-resistente, em casos onde se observa resistência a todos os fármacos de primeira linha, bem como a pelo menos uma fluoroquinolona e um injetável; e, por fim, TB totalmente-resistente, descrita como resistente a todos os fármacos de primeira e segunda linha. A resistência pode ser transmitida ou adquirida, sendo a primeira o resultado da transmissão direta de estirpes resistentes no momento da infeção, por parte de uma pessoa infetada com a estirpe resistente; e a segunda, consequência do aparecimento de mutações. Estas mutações são maioritariamente espontâneas e observadas em genes que codificam para as proteínas alvo dos fármacos. O atual tratamento da TB suscetível a fármacos inclui seis meses de tratamento, aplicando nos primeiros 2 meses uma terapia com isoniazida, rifampicina, pirazinamida e etambutol, seguidos de 4 meses com isoniazida e rifampicina. Estes fármacos de primeira geração têm como alvo enzimas essenciais ao funcionamento do bacilo, como por exemplo, enzimas envolvidos na síntese de componentes da membrana celular e na síntese proteica. A bedaquilina e a delamanida, fármacos recentemente aprovados, são usados para o tratamento da TB multi-resistente, sendo ambos ativos contra as formas replicantes e não-replicantes do bacilo e contra estirpes suscetíveis e resistentes aos fármacos. Através de um screening contra o Mtb (estirpe H37Rv) de uma biblioteca de compostos do nosso laboratório foi observado que a classe das azaauronas exibia atividade inibitória promissora. Contudo, estes compostos apresentavam problemas relativamente à solubilidade aquosa. Assim sendo, novos compostos foram sintetizados com o objetivo de melhorar a solubilidade aquosa, tentando manter a atividade antimicrobiana que apresentavam. A via sintética das azaaurones inclui quatro passos: (1) acilação de uma anilina usando cloroacetonitrilo, (2) proteção do grupo amina da anilina com grupos acetilo, carbamoilo e benzoilo, (3) ciclização intramolecular, e (4) condensação aldólica. Neste trabalho realizaram-se várias tentativas de otimização dos rendimentos obtidos no passo da ciclização (passo 3), tendo-se testado diferentes bases (com diferentes forças) e o número de equivalentes dos reagentes. Os melhores resultados foram conseguidos com trietilamina (3 eq, 69%) e K2CO3 (1.2 eq, 56%) para os derivados N-acetilo e N-carbamoilo, respetivamente. Foi possível sintetizar uma pequena biblioteca de novos compostos (4b-d, f), com rendimentos moderados a bons. Estes foram caraterizados por 1H NMR, 13C NMR, COSY, HSQC, HMBC e espectrometria de massa. O grau de pureza foi determinado por HPLC. Como mencionado anteriormente, as azaauronas iniciais não apresentavam bons valores de solubilidade o que representa uma grande desvantagem destes compostos dado que a solubilidade é umas das principais e mais importantes propriedades físico-químicas dos compostos na descoberta e desenvolvimento de fármacos. Compostos com reduzida solubilidade aquosa estão associados a problemas de má absorção, e consequentemente, reduzida biodisponibilidade, podendo também afetar os ensaios biológicos, SAR e atividade farmacológica. Assim sendo, é importante determinar este parâmetro o mais cedo possível, para evitar posteriores complicações em fases avançadas do processo de desenvolvimento do fármaco. Existem dois tipos de solubilidade, a termodinâmica e a cinética, que podem ser determinadas dependendo da informação pretendida. Essencialmente, a solubilidade termodinâmica reflete “Até que ponto o composto dissolve?”, e, inversamente, a solubilidade cinética representa “Até que ponto o composto precipita?”. A solubilidade cinética e a termodinâmica apresentam várias diferenças. Nos métodos de determinação da solubilidade cinética, o ensaio começa com o composto previamente dissolvido num solvente orgânico (normalmente, DMSO), ao contrário do que se verifica nos métodos termodinâmicos, que utilizam o composto no estado sólido. Os métodos cinéticos são normalmente utilizados na fase inicial da descoberta de fármacos, dada a facilidade e rapidez dos mesmos; contrariamente ao que se verifica para os métodos termodinâmicos, aplicados em fases posteriores. Neste trabalho foi desenvolvido um método analítico para determinar a solubilidade cinética. Este método consistiu na adição do composto (pré-dissolvido em DMSO) em tampão fosfato e, depois da incubação e centrifugação, o sobrenadante foi analisado por HPLC. As condições do HPLC foram otimizadas para todos os compostos bem como para o padrão utilizado (ácido salicílico). O valor de solubilidade foi determinado através de uma curva de calibração em DSMO. O objetivo de melhorar a solubilidade foi cumprido, quando comparado com o composto inicial 4a, apesar de ter sido observada uma diminuição da atividade para os compostos sintetizados. Esta redução da atividade pode estar relacionada com o perfil lipofílico da membrana celular do Mtb. Foi analisada a possibilidade de estabelecer uma correlação entre a solubilidade e a atividade, contudo não foi possível dado o reduzido número de compostos. Futuramente, deverá ser alargada a biblioteca de derivados de azaauronas, sintetizando compostos com diferentes grupos introduzidos na posição R2 (Figure 8). Tal deverá permitir estabelecer SAR e, também, uma correlação entre a atividade e a solubilidade aquosa para esta família de compostos.

Tuberculosis (TB) is an infectious disease caused by Mycobacterium tuberculosis (Mtb) included in the top 10 causes of death worldwide. TB represents a major threat to public health due to the continuous emergence of new cases (10 million reported in 2018) and to the growing antimicrobial resistance. Besides the resistance against current drugs, the absence of an efficacious vaccine, the duration of the treatment and the slow development of new drugs against TB are the main factors that prevent the eradication of TB. Recently, our group discovered that azaaurone based scaffold displays optimal antimycobacterial activity, including multidrug- and extensively drug-resistant strains of Mtb. However, these hits showed a poor aqueous solubility. This property represents a key role in drug discovery and development since a low solubility may affect the screening assays, lead to poor absorption and, consequently, low bioavailability of compounds. To overcome these liabilities, structural modifications were performed in azaaurone scaffold, introducing more hydrophilic and non-planar moieties in order to increase the aqueous solubility. There are two types of solubility that can be measured, kinetic and thermodynamic, depending on the information required, and several strategies can be used to obtain more soluble drug candidates. In this thesis, we developed a solubility assay that allowed us to measure the kinetic solubility of various azaaurones derivatives. The method was validated using an external standard, salicylic acid, a compound that is completely soluble in water. This method was useful to confirm the increase in aqueous solubility of the new synthetized compounds, and to evaluate a possible correlation between the antimycobacterial activity and its aqueous solubility. In this work we were able to obtain compounds (4a-d, f) with increased aqueous solubility, although, the activity decreased when compared with reference compound 4a. Therefore, it is not possible to establish a correlation due to the reduced number of compounds.