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Hereditary anemia - characterization of the genetic basis and subjacent mechanisms

2020DissertaĆ§Ć£o de mestrado Acesso aberto
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datacite.subject.fosCiĆŖncias Naturais::CiĆŖncias BiolĆ³gicaspt_PT
dc.contributor.advisorFaustino, Paula
dc.contributor.advisorRebelo, Maria Teresa Ferreira Ramos Nabais de Oliveira,1964-
dc.contributor.authorFaleiro, BĆ”rbara DĆ¼emke Coelho
dc.date.accessioned2020-12-03T17:57:02Z
dc.date.available2022-10-21T00:30:50Z
dc.date.issued2020
dc.date.submitted2020
dc.descriptionTese de mestrado em Biologia Humana e Ambiente, Universidade de Lisboa, Faculdade de CiĆŖncias, 2020pt_PT
dc.description.abstractAnemia is a global public health problem affecting 24.8 % of the world population and is mostly caused by nutritional iron deficiencies. Additionally, molecular mechanismĀ“s disturbances associated with the iron homeostasis may cause hereditary anemias of challenging diagnosis, such as Iron-Refractory Iron Deficiency anemia (IRIDA). Alternatively, globin chains structure or synthesis changes may lead to hemoglobinopathies, another type of hereditary anemia. Firstly, in order to explain atypical hemoglobinopathiesā€™ phenotypes and understand underlying pathophysiological mechanisms, 15 hemoglobinopathies clinical cases were studied by PCR, gapPCR, Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification (MLPA) and automated Sanger sequencing of the various globin genes. These techniques made it possible to clarify the molecular causes behind these complex phenotypes, with molecular lesions being responsible for rare hemoglobin structural variants, Ī²- and Ī±-thalassemias, and the presence of polymorphisms that modulate the expression of globin genes. Secondly, we focused on ten IRIDA suspects, by amplifying their TMPRSS6 gene by long-PCR followed by Next-generation Sequencing and in silico analysis for predicting the possible pathogenic effect of the detected genetic variants. Through this analysis, only the phenotype of one patient could be justified by the presence of digenic inheritance of the novel damaging mutation (TMPRSS6: c.871G>A; G291S) and 3 common modulating SNPs in the same gene (K253E, S361S and Y739Y), in addition to the co-inheritance of the ā€“Ī± 3.7kb -thalassemia allele, which may add up to an IRIDA-like phenotype. Thirdly, to detect the presence and understand the roles and of common SNPs in genes related to iron metabolism, a case-control study was performed to investigate the influence of TMPRSS6 (V736A and K253E) and HFE (H63D and C282Y) on the hematological and iron parameters of 317 Portuguese subjects divided into 3 groups: Ī²-thalassemia trait (BTT), iron deficiency anemia (IDA) and controls. Subjects were genotyped using PCR-(RFLP) Restriction fragment length polymorphism and Amplification-Refractory Mutation System (ARMS)-PCR techniques. Results suggests that both heterozygous (TC) and homozygous (CC) genotypes of V736A act as a protective factor against IDA, and that in the female control group, the CC genotype had significantly increased MCV, MCH and TSAT parameters when compared to the wild type (TT). Logistic regression results detected a positive association between H63D variant and RDW in control subjects, and an association between this variant and the iron parameters of BTT subjects. Finally, we evaluated the diagnostic performance of 13 mathematical indices for differentiating microcytic anemia in BTT and or IDA subjects, to find which ones would better apply to the Portuguese population. When accessing the performance of the indices we found that for a female adult Portuguese population the best performing ones where RBC, G&K and RDWI, similarly to other Mediterranean countries, and also France and Brazil, the latter probably resulting from migratory movements and Portuguese ancestry, respectively. Results imply that these indices can aid diagnosing the condition underlying microcytic anemia, recognizing individuals suspected of BTT and forwarding them to additional biochemical and molecular tests. The study of hereditary anemia made it possible for us to assign a correct diagnostic to the studied patients, allowing for correct clinical management and genetical counselling, that in turn, improves their quality of life. Additionally, this work has reinforced the importance of the study of molecular markers and use of non-molecular tools complementary to the already implemented diagnostic techniques.pt_PT
dc.description.abstractA anemia Ć© um problema de saĆŗde pĆŗblica global que afeta 24,8 % da populaĆ§Ć£o mundial, sendo maioritariamente causada por deficiĆŖncias nutricionais de ferro. Para alĆ©m disso, quando perturbados os mecanismos moleculares associados Ć  homeostase do ferro Ć© possĆ­vel que surjam anemias hereditĆ”rias de difĆ­cil diagnĆ³stico, como Ć© o caso da Iron-Refractory Iron Deficiency Anemia (IRIDA). Por outro lado, alteraƧƵes na sĆ­ntese ou estrutura das cadeias globĆ­nicas originam tambĆ©m anemias hereditĆ”rias denominadas hemoglobinopatias. Primeiramente, de forma a explicar fenĆ³tipos atĆ­picos de hemoglobinopatias e entender os mecanismos fisiopatolĆ³gicos subjacentes aos mesmos, 15 casos clĆ­nicos de hemoglobinopatias foram estudados utilizando as metodologias PCR, gap-PCR, Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification (MLPA) e sequenciaĆ§Ć£o automĆ”tica de Sanger para analisar vĆ”rios genes globĆ­nicos (HBB; HBD; HBG1; HBG2; HBA1; e HBA2). Este estudo permitiu o esclarecimento das causas moleculares associadas aos fenĆ³tipos complexos destes indivĆ­duos, nos quais estavam presentes lesƵes moleculares responsĆ”veis por: variantes estruturais raras de hemoglobina, talassĆ©mias do tipo alfa e beta e polimorfismos responsĆ”veis pela modulaĆ§Ć£o da expressĆ£o dos genes globĆ­nicos De seguida, o trabalho focou-se no estudo de 10 casos suspeitos de IRIDA, atravĆ©s da amplificaĆ§Ć£o do gene TMPRSS6, que codifica a proteĆ­na matriptase-2, por PCR-longo e anĆ”lise por Next-generation Sequencing, seguida de anĆ”lise in silico, de forma a prever o possĆ­vel efeito patogĆ©nico na proteĆ­na de variantes genĆ©ticas novas/raras. Recorreu-se Ć  ferramenta bioinformĆ”tica Human Splicing Finder de forma a detetar potenciais alteraƧƵes no processo de splicing e Ć s ferramentas PolyPhen-2, SIFT e Missense3D, a fim de analisar o impacto das variantes missense ao nĆ­vel da estrutura e funĆ§Ć£o da proteĆ­na codificada. Esta investigaĆ§Ć£o permitiu apenas justificar o fenĆ³tipo de um dos casos em estudo, cujo quadro clĆ­nico julga-se ser fruto da heranƧa digĆ©nica de uma nova mutaĆ§Ć£o patogĆ©nica (TMPRSS6: c.871G>A; G291S) e 3 polimorfismos modeladores no mesmo gene (K253E, S361S e Y739Y) em conjunto com a coheranƧa do alelo para a deleĆ§Ć£o Ī±-talassĆ©mica de 3,7 kb, que levam Ć  presenƧa de um fenĆ³tipo tipo-IRIDA. De forma a detetar a presenƧa e entender o papel de polimorfismos comuns em genes relacionados com o metabolismo do ferro, foi realizado um estudo populacional de associaĆ§Ć£o para investigar a influĆŖncia que os polimorfismos nos genes TMPRSS6 (V736A e K253E) e HFE (H63D e C282Y) tĆŖm sobre os parĆ¢metros hematolĆ³gicos e do status do ferro de 317 indivĆ­duos adultos, portugueses, divididos em 3 grupos: portadores de Ī²-talassĆ©mia (BTT), indivĆ­duos com anemia ferropĆ©nica (IDA) e controlos normais. Os indivĆ­duos foram genotipados recorrendo Ć s tĆ©cnicas PCR-(RFLP) Restriction fragment length polymorphism e Amplification-Refractory Mutation System (ARMS)-PCR. Os resultados sugerem que ambos os genĆ³tipos heterozigĆ³tico (TC) e homozigĆ³tico (CC) da variante V736A exercem um efeito protetor contra a anemia ferropĆ©nica e que indivĆ­duos controlo do sexo feminino com o genĆ³tipo CC tĆŖm os parĆ¢metros volume globular mĆ©dio (MCV), hemoglobina corpuscular mĆ©dia (MCH) e saturaĆ§Ć£o de transferrina (TSAT) significativamente aumentados quando comparados com o genĆ³tipo wild-type (TT). Os resultados da anĆ”lise de regressĆ£o logĆ­stica detetaram uma associaĆ§Ć£o positiva entre a presenƧa da variante H63D e os nĆ­veis de dispersĆ£o do volume eritrocitĆ”rio (RDW) nos controlos saudĆ”veis e verificou-se uma associaĆ§Ć£o entre esta mesma variante e os parĆ¢metros do status do ferro de indivĆ­duos BTT. ApĆ³s o estudo de associaĆ§Ć£o, foi testado o desempenho de diagnĆ³stico de 13 Ć­ndices matemĆ”ticos diferenciadores de anemia microcĆ­tica em indivĆ­duos BTT ou IDA, com o intuito de determinar quais seriam os mais adequados Ć  populaĆ§Ć£o Portuguesa. A anĆ”lise revelou que para uma populaĆ§Ć£o adulta de mulheres portuguesas, os Ć­ndices com melhor desempenho sĆ£o RBC, G&K e RDWI. Os resultados foram ao encontro do reportado para outros paĆ­ses MediterrĆ¢nicos onde a Ī²-talassĆ©mia Ć© endĆ©mica. O mesmo verificou-se para o Brasil e FranƧa, provavelmente devido, respetivamente, Ć  heranƧa portuguesa e a fluxos migratĆ³rios. No geral, os resultados indicam que estes Ć­ndices podem auxiliar no diagnĆ³stico da causa subjacente Ć  anemia microcĆ­tica, reconhecendo indivĆ­duos suspeitos de BTT e encaminhando-os para testes bioquĆ­micos e moleculares adicionais. Em suma, este trabalho permitiu entender melhor as alteraƧƵes genĆ©ticas responsĆ”veis pelas anemias hereditĆ”rias, bem como a forma como estas alteram o metabolismo do ferro, levando a um melhor conhecimento dos fatores que conduzem Ć  variabilidade clĆ­nica em pacientes com estas doenƧas. ConcluĆ­mos tambĆ©m que o estudo destas patologias tornou possĆ­vel um correto diagnĆ³stico de algum dos indivĆ­duos estudados, permitindo um adequado acompanhamento clĆ­nico e aconselhamento genĆ©tico, que leva por sua vez a uma melhoria da qualidade de vida dos casos em questĆ£o. Ademais, este trabalho reforƧa a importĆ¢ncia do estudo dos marcadores moleculares e do uso de ferramentas nĆ£o moleculares que complementam as tĆ©cnicas de diagnĆ³stico jĆ” implementadas.pt_PT
dc.identifier.tid202599256pt_PT
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/10451/45120
dc.language.isoengpt_PT
dc.relation2012DGH720pt_PT
dc.relation2013DGH910pt_PT
dc.relationPOCI-01-0145-FEDER022184pt_PT
dc.subjectAnemias hereditƔriaspt_PT
dc.subjectHemoglobinopatiaspt_PT
dc.subjectIRIDApt_PT
dc.subjectNext-Generation Sequencingpt_PT
dc.subjectTMPRSS6pt_PT
dc.subjectHFEpt_PT
dc.subjectPortadores de Ī²-talassĆ©miapt_PT
dc.subjectAnemia ferropƩnicapt_PT
dc.subjectAnemia microcĆ­ticapt_PT
dc.subjectƍndices hematolĆ³gicospt_PT
dc.subjectTeses de mestrado - 2020pt_PT
dc.titleHereditary anemia - characterization of the genetic basis and subjacent mechanismspt_PT
dc.typemaster thesis
dspace.entity.typePublication
rcaap.rightsopenAccesspt_PT
rcaap.typemasterThesispt_PT
thesis.degree.nameMestrado em Biologia Humana e Ambientept_PT

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