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Publicação
Computer-assisted design and synthesis of DNA-G4:
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Autores
Orientador(es)
Resumo(s)
O cancro é uma doença multifatorial, caracterizada pelo crescimento anormal de células que podem invadir tecidos próximos ou mais distantes em um processo denominado metástase. Recentemente, vários estudos têm sido publicados com a conclusão de que o cancro pode surgir devido a fatores externos (fatores químicos, radiação, meio ambiente, entre outros) e internos (hormonas e mutações). Atualmente, existem diversos tratamentos para o cancro,
como cirurgia, quimioterapia, radioterapia e laserterapia. No entanto, devido à mutações e resistência aos tratamentos, o cancro ainda é uma doença com poucas soluções de tratamento eficazes. Mutações em regiões específicas do genoma, como o c-MYC, são cada vez mais um objeto de estudo central, devido ao seu envolvimento direto em processos celulares como o controlo do ciclo celular, bem como na proliferação e diferenciação de células cancerígenas. A transcrição do c-MYC pode ser regulada por diferentes mecanismos e proteínas, incluindo por estruturas como o G-quadruplexo (G4) localizadas na região promotora deste gene. Os G4s são estruturas secundárias de DNA que, apesar de serem dinâmicas, são relativamente estáveis. Estas estruturas são atualmente investigadas como alvos terapêuticos com o objetivo de regular negativamente a transcrição de oncogenes, como o c-MYC. Eles podem ser desdobrados pela ação de enzimas, como as helicases. As helicases são uma família de proteínas fundamentais nos processos de transcrição e replicação, uma vez que são capazes de se ligar a estruturas secundárias de ácidos nucléicos e desenrolá-las. Algumas helicases, como a DHX36, são mais específicas a desenrolar estruturas como os G4 do que em estruturas em dupla helice de DNA e RNA.
Atualmente, diversas pequenas moléculas capazes de se ligar aos G4, estão em processo de estudo visando melhorar a sua seletividade para o G4 em relação a outras estruturas secundárias como a dupla helice de DNA. Apesar da enorme quantidade de estudos em torno deste tema, apenas 3 pequenas moléculas chegaram a ensaios clínicos, embora nenhuma tenha sido aprovada com esse tipo de mecanismo de ação. Com isto em mente, este projeto propõe uma nova abordagem ao desenho de ligandos de G4. O nosso alvo é a interação entre o c-MYC G4 e o seu regulador negativo, a helicase DHX36, com a intenção de conseguir uma maior seletividade, sem comprometer a eficiência da estabilização do G4 utilizando pequenas moléculas. Para atingir esse objetivo principal, este trabalho foi planeado usando uma abordagem multidisciplinar. Na primeira fase desta tese de mestrado, foi aplicada uma abordagem in silico para o desenho de uma biblioteca de compostos e, posterior seleção e filtragem dos compostos alvo. A segunda fase focou-se em estudos de vias de síntese química para obter os compostos selecionados, complementada por uma abordagem de validação experimental in vitro para avaliar a capacidade de estabilização
do G4 pelas moléculas sintetizadas. Assim, no decorrer desta tese de mestrado, construímos e analisamos uma biblioteca virtual quimicamente diversa, composta por 1080 derivados de indoloisoquinolinas com propriedades ‘drug-like’.
Essa biblioteca foi construída a partir de dados da literatura que indicam que moléculas com anéis aromáticos fundidos podem interagir com o G4 e que as cadeias laterais com grupos alifaticos/aromáticos que apresentem átomos dadores/aceitadores de hidrogénio podem estabilizar o complexo do composto com o G4, através de interações com as guaninas e com os grupos fosfatos da sua cadeia principal. De modo a avaliar quais os compostos seriam promissores, recorremos ao docking molecular. Com este fim, selecionámos três programas diferentes
de docking, com diferentes ’scoring functions’ e/ou algoritmos de procura. Para organizar os resultados vindos dos diferentes programas, utilizámos um protocolo de ’consensus scoring’ para ordenar as melhores moléculas identificadas pelos diferentes programas.
Analisando a classificação de compostos obtidos pelo ’consensus’, observámos que as dissubstituições assimétricas feitas ao núcleo da indoloisoquinolina apresentam melhores energias de ligação com o G4 e que metilpiridinas e acetilpiridinas são as cadeias laterais com maior prevalência nos compostos com maior afinidade. Além disso, conseguimos corroborar o que já foi descrito na literatura, observando que o núcleo da indoloisoquinolina interage com as guaninas do G4 através de ligações π e que as cadeias laterais podem interagir com as guaninas por π-π stacking ou com o ’backbone’ de fosfato da cadeia de DNA através de interações eletrostáticas.
Em seguida, estabelecemos duas rotas sintéticas para alcançar a di-substituição assimétrica do núcleo de 5-amino-8-cloro-11H-indolo[3,2-c]isoquinolina. A primeira abordagem explorou a reatividade nucleofílica do grupo 5-amino. Para tal, sintetizámos, com rendimentos moderados (38-47%), o composto de partida (etil 5-amino-8-cloro-11H-indolo[3,2-c]isoquinolina-11-carboxilato - 68) através de uma ciclização por tandem catalisada por base (NaH), numa reação
‘one-pot-two-step’. De seguida, tentámos introduzir a cadeia lateral através de reações SN2 com 2 reagentes eletrofílicos diferentes, com bromo e tosilo como grupos abandonantes e diferentes condições de reação que já haviam sido testadas no nosso laboratório para reações similares. Infelizmente, não tivemos sucesso na obtenção dos produtos 5-amino-monosubstituidos. A segunda rota sintética começou por explorar a reatividade do azoto presente no indol. A hidrólise do grupo carboxilato do composto 68 permitiu obter, com ótimos rendimentos (80-93%), o derivado com o indol desprotegido (69). Este foi então usado para obter três derivados de 11-metilpiridina (70, 71 e 73) e dois derivados de 11-etilamina (76 e 77 com rendimento moderado (21-39%) a bom (57-86%) dos compostos puros isolados. Prosseguimos com o nosso objetivo de sintetizar compostos di-substituidos, tentando realizar
a substituição na posição 5-amino. Começámos com o composto 70 como material inicial e usámos as melhores condições de reação para a SN2 do azoto do grupo indol: Cs2CO3 como base e acetonitrilo em refluxo como solvente. Além disso, aumentamos o tempo de reação, mas mais uma vez, a reação falhou.
Finalmente, para testar a capacidade de estabilização da estrutura DNA-G4 pelos compostos sintetizados, realizamos um ensaio de fusão do DNA por método de Transferência de Energia de ressonância por fluorescencia (FRET). Através deste ensaio, concluímos que todas as indoloisoquinolinas ensaiadas não são bons ligandos nem bons estabilizadores de estruturas paralelas de G4, apresentando um ΔTm menor do que 1 ºC. Este resultado vai ao encontro das conclusões retiradas dos estudos de docking molecular feitos, que indicam que compostos di-substituídos são os melhores ligandos.
No geral, os objetivos específicos propostos para este trabalho foram alcançados, ou seja, conseguimos fazer o desenho e screening virtual dos detivados de indoloisoquinolinas, sintetizar moleculas com diferentes capacidades inibitórias previstas pelo estudo computacional e avaliar a habilidade de estabilizar o G4 através de ensaios de FRET. Os resultados obtidos permitiram concluir que devido à baixa reatividade do grupo 5-NH2, é necessário desenhar uma abordagem sintética diferente para que seja possível obter os derivados 5,11-di-substituídos desenhados.
Com isso em mente, os próximos passos irão focar-se na definição de qual a melhor abordagem e sintetizar os compostos mais promissores, nomeadamente, os di-substituidos. Assim, a partir deles poderemos avaliar, não só a sua capacidade de estabilizar o G4, mas também de inibir a interação com a helicase. Além disso, mais estudos computacionais, como dinâmica molecular, podem ser feitos para que possamos perceber melhor a interação dos derivados com o c-MYC G4 e, com isso, obter um maior conhecimento da relação estrutura-atividade. A partir dos dados obtidos desses estudos, poderemos otimizar ainda mais os compostos da nossa biblioteca e identificar derivados com melhor afinidade e seletividade para a interação c-MYC G4:helicase.
Gene mutations in specific regions of the genome such as c-MYC, have been deserving extra attention, due to their involvement in cellular processes, like cell progression, and cancer cell proliferation and differentiation. c-MYC transcription has been described to be regulated by several mechanisms and proteins, including G-quadruplex (G4) structures in its promoter region. These dynamic but relatively stable secondary DNA structures have been currently tested as therapeutic targets to downregulate the transcription of oncogenes such as c-MYC. Helicases, such as DHX36, a family of proteins fundamental in the transcription and replication processes, can bind to nucleic acids’ and unfold them. Currently, different small molecules are being developed to target G4 structures, however with still low therapeutic efficacy. With this project, we propose a new approach to G4-ligands design, focused on targeting simultaneously the c-MYC G4 and its negative regulator, the helicase DHX36. To tackle this goal, we built and evaluated a custom-made virtual library of 1080 ‘drug-like’ indoloisoquinoline derivatives for binding to c-MYC G4. Molecular docking studies showed that asymmetric N11-N5-di-substitutions with methylpyridines and acetylpyrydines of the 5-amino-indoloisoquinoline core exhibited better binding energies to G4. Taking this results into account, we synthesize derivatives of indoloisoquinoline 68 and 69, obtained with a two-step-one-pot base-catalyzed reaction, through two different synthetic routes. The first one explored the nucleophilic reactivity of the 5-amino group without success, while the second route explored the reactivity of the indole nitrogen, allowing the synthesis of derivatives 70, 71, 73, 76, and 77) with moderate (21-39%) to good (57-86%) yield of isolated pure compounds. Using a FRET melting assay we concluded that all synthesized mono-substituted indoloisoquinolines are poor stabilizers of G4, which agrees with the molecular docking studies. These results indicate that different synthetic approaches are required to synthesize the most promising derivatives identified from the docking calculations.
Gene mutations in specific regions of the genome such as c-MYC, have been deserving extra attention, due to their involvement in cellular processes, like cell progression, and cancer cell proliferation and differentiation. c-MYC transcription has been described to be regulated by several mechanisms and proteins, including G-quadruplex (G4) structures in its promoter region. These dynamic but relatively stable secondary DNA structures have been currently tested as therapeutic targets to downregulate the transcription of oncogenes such as c-MYC. Helicases, such as DHX36, a family of proteins fundamental in the transcription and replication processes, can bind to nucleic acids’ and unfold them. Currently, different small molecules are being developed to target G4 structures, however with still low therapeutic efficacy. With this project, we propose a new approach to G4-ligands design, focused on targeting simultaneously the c-MYC G4 and its negative regulator, the helicase DHX36. To tackle this goal, we built and evaluated a custom-made virtual library of 1080 ‘drug-like’ indoloisoquinoline derivatives for binding to c-MYC G4. Molecular docking studies showed that asymmetric N11-N5-di-substitutions with methylpyridines and acetylpyrydines of the 5-amino-indoloisoquinoline core exhibited better binding energies to G4. Taking this results into account, we synthesize derivatives of indoloisoquinoline 68 and 69, obtained with a two-step-one-pot base-catalyzed reaction, through two different synthetic routes. The first one explored the nucleophilic reactivity of the 5-amino group without success, while the second route explored the reactivity of the indole nitrogen, allowing the synthesis of derivatives 70, 71, 73, 76, and 77) with moderate (21-39%) to good (57-86%) yield of isolated pure compounds. Using a FRET melting assay we concluded that all synthesized mono-substituted indoloisoquinolines are poor stabilizers of G4, which agrees with the molecular docking studies. These results indicate that different synthetic approaches are required to synthesize the most promising derivatives identified from the docking calculations.
Descrição
Tese de mestrado, Química Medicinal e Biofarmacêutica, 2022, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia.
Palavras-chave
G-quadruplex c-MYC Helicase Indoloisoquinolines Molecular docking Teses de mestrado - 2022