Publication
In vivo and in real-time mechanisms of synaptic bouton formation
| datacite.subject.fos | Departamento de Biologia Vegetal | pt_PT |
| dc.contributor.advisor | Teodoro, Rita | |
| dc.contributor.advisor | Gomes, Rui Artur Paiva Loureiro, 1958- | |
| dc.contributor.author | Fernandes, Andreia Rubina Rodrigues | |
| dc.date.accessioned | 2018-01-15T12:16:54Z | |
| dc.date.available | 2020-11-11T01:30:13Z | |
| dc.date.issued | 2017 | |
| dc.date.submitted | 2017 | |
| dc.description | Tese de mestrado, Biologia Molecular e Genética, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2017 | pt_PT |
| dc.description.abstract | A functional nervous system relies on the communication between neurons via highly specialized structures, called synapses. During development, neuronal morphology and wiring establishment are genetically determined but neuronal structural and function can be altered by changing levels of activity, a process known as synaptic plasticity. Adult neuronal circuits remain plastic and this feature is what allows us to store information and adapt to the environment. Defects in synaptic connectivity and activity-dependent plasticity are characteristic of neurodevelopmental and neurodegenerative disorders. Notoriously, recent studies highlight a link between functional defects in the presynaptic elements of neurons, called synaptic boutons, and the origin of several of these diseases. Presynaptic boutons, round varicosities conserved from invertebrates to man, are highly dynamic structures where synapses are located and where neurotransmission occurs. Despite being one of the main synaptic compartments, very little is known about the mechanism and dynamics of their genesis. Several studies contributed to the understanding of this question, but detailed mechanistic information regarding bouton outgrowth is still lacking. The purpose of this work is to acquire fundamental knowledge regarding how presynaptic boutons are formed and integrated into wired neurons. The powerful model synapse of Drosophila neuromuscular junction (NMJ) was adopted to dissect the details of bouton outgrowth in vivo and in real-time since it exhibits robust structural plasticity and the synapses formed on particular muscles have characteristic shapes and discernible boutons. The analysis was performed on the 3rd instar larvae because developmental bouton addition is nearly complete, and at this stage acute structural plasticity can be induced by patterned stimulation of motor neurons (MNs) using a variety of stimuli (high K+ solution, electrical activity and optogenetics). Well-established protocols using spaced high K+ paradigms were adopted to induce the rapid addition of synaptic boutons at this synapse. Neuronal migration and growth are critical events for the correct development and wiring of the nervous system. To date, the mechanisms described to give rise to presynaptic boutons involve the formation of filopodia or lamellipodia structures. However, performing high temporal resolution time-lapse imaging of unanesthetized Drosophila larval NMJs revealed a new, unreported, mechanism of presynaptic bouton addition into mature neurons. It was found that addition of synaptic boutons in response to acute activity does not occur like in the embryonic stage, where a growth cone differentiates into round boutons. Instead, new boutons rapidly emerge in a manner strongly resembling a mechanism known-to-be used by some cells in migration and tissue invasion. Considering that the NMJ is deeply inserted into the muscle, for the MN to include new boutons it must further invade the muscle, which mechanistically is not very different from migration across other tissues. It is suggested that MNs have possibly adopted a strategy that combines this form of migration with activity-dependent signaling pathways to modulate the formation of synaptic boutons during intense muscular activity. Additionally, manipulating the pathways that regulate this mechanism exposed an intricate interplay between MNs and the muscle in the regulation of the number of activity-dependent boutons. Interestingly, the movies also showed a strong correlation between muscle contraction and bouton formation. This finding implied that the muscle mechanics probably has an active role on the MN, that can be either by setting up de formation of new boutons in primed sites or by increasing the dynamics of this process in situations of increased stress. It is proposed that a balance of mechanical forces and biochemical signaling are probably coordinated during structural plasticity upon intense muscle activity. This research further expands our understanding of the mechanisms that control presynaptic growth and assembly in mature neurons. Further dissection of this phenomenon will contribute to uncover general principles that link normal development and function to dysfunction and disease, providing new insights into neuronal disease etiology and opening new avenues for the development of strategies to promote neuronal complexity and possibly delay symptoms associated with neuronal diseases. | pt_PT |
| dc.description.abstract | O funcionamento do sistema nervoso depende do estabelecimento da associação e comunicação entre neurónios, que ocorre através de estruturas altamente especializadas, designadas de sinapses. Durante o desenvolvimento, a morfologia dos neurónios e a estrutura das redes neuronais são geneticamente programados, mas a estrutura e a função dos neurónios pode ser remodelada em resposta a alterações nos níveis de atividade, um processo conhecido como plasticidade sináptica. No adulto, os circuitos neuronais retêm características plásticas e é esta maleabilidade do tecido nervoso que nos permite adquirir e armazenar informação e adaptar a alterações no ambiente. Defeitos na conectividade sináptica e na plasticidade dependente da atividade são característicos de doenças neurodegenerativas, como a Doença de Alzheimer e a Esclerose Lateral Amiotrófica, e, usualmente precedem a morte neuronal, que é a última causa dos sintomas molestos que acompanham este tipo de doenças. Adicionalmente, alterações na plasticidade estrutural também são um mecanismo comum a contribuir para os defeitos cognitivos e funcionais observados em doenças do desenvolvimento neuronal, como o Autismo e a Deficiência intelectual. Notoriamente, estudos recentes salientam uma ligação entre defeitos funcionais observados nos elementos pré-sinápticos dos neurónios e a origem de várias doenças destes tipos. As sinapses consistem em junções intercelulares assimétricas nas quais é possível distinguir, morfológica e funcionalmente, dois compartimentos, um pré-sináptico e um pós-sináptico. Os terminais pré-sinápticos dos neurónios são constituídos por varicosidades redondas conhecidas como botões sinápticos, que são estruturas altamente conservadas desde os invertebrados até ao homem. Os botões sinápticos são o local onde as sinapses são organizadas e onde a transmissão nervosa ocorre. Estas estruturas são muito dinâmicas e estruturalmente plásticas, alterando o tamanho e o número em resposta a modificações na atividade. Apesar de constituírem um dos principais compartimentos sinápticos, pouco se sabe acerca dos mecanismos que regulam a sua formação. Durante o desenvolvimento, os axónios dos neurónios, que ainda não estabeleceram contactos sinápticos, têm estruturas altamente dinâmicas e móveis na sua extremidade distal designadas de cones de crescimento. Morfologicamente, os cones de crescimento têm uma forma cónica e formam dois tipos de protrusões celulares: filopódios e, entre estes, lamelipódios. Os cones de crescimento guiam os axónios até ao seu alvo-sináptico, que pode ser outro neurónio ou outro tipo de célula, e após chegada ao seu destino final os cones de crescimento diferenciam-se em botões redondos. Mas, durante o crescimento, os axónios pré-conectados devem continuar a alongar para acompanhar a mudança de tamanho do animal. Além disso, no adulto a formação de circuitos neuronais funcionais e a ocorrência de plasticidade sináptica são processos que dependem criticamente da montagem e desmontagem de sinapses. Assume-se que durante o crescimento dos organismos e durante a plasticidade sináptica a formação de novos botões segue os princípios do crescimento neuronal. Contudo, a visualização detalhada e informação sobre o mecanismo e a dinâmica do crescimento dos botões no adulto é quase inexistente. Este trabalho tem como propósito a aquisição de conhecimento básico, mas fundamental, acerca do mecanismo de formação e integração de novos botões pré-sinápticos em neurónios maduros e pré-conectados. Um dos exemplos mais estudados de uma sinapse química, a forma predominante de comunicação entre os neurónios, é a sinapse formada entre um neurónio motor e o músculo, a qual é designada de junção neuromuscular. As junções neuromusculares são estruturas especializadas para proporcionar excitação transiente e à prova de falhas da célula muscular pós-sináptica assegurando contração muscular sempre que o neurónio motor estiver ativo para suportar a geração de movimento, uma qualidade importante dos animais. Adotou-se a junção neuromuscular da Drosophila para estudar o mecanismo de formação dos botões sinápticos dado que esta sinapse exibe plasticidade estrutural robusta e as sinapses formadas em músculos particulares apresentam formas bem características e botões claramente discerníveis. A análise foi efetuada no terceiro estadio larvar uma vez que neste estadio a adição de botões que acompanha o desenvolvimento da junção neuromuscular está quase completa e é possível induzir plasticidade estrutural de forma aguda. A rápida adição de botões pré-sinápticos pode ser induzida em resposta a determinados padrões de atividade utilizando uma variedade de estímulos (solução com K+ elevado, atividade elétrica e optogenética). Neste estudo, para induzir plasticidade estrutural na junção neuromuscular adotou-se protocolos baseados em paradigmas de despolarização espaçada usando uma solução com K+ elevado. A observação dos novos botões (designados botões dependentes-da-atividade) foi efetuada em amostras vivas e em amostras fixadas de forma a extrair não só a dinâmica como também informação quantitativa a partir de larvas sujeitas a plasticidade estrutural A migração e o crescimento neuronal são eventos críticos para o desenvolvimento correto e estabelecimento dos circuitos neuronais. Até à data, os mecanismos descritos que participam na formação dos botões pré-sinápticos, envolvem a formação de filopódios ou lamelipódios. No entanto, a realização de microscopia confocal com lapso de tempo em junções neuromusculares de larvas de Drosophila submetidas a plasticidade estrutural revelou um novo mecanismo de adição de botões pré-sinápticos em neurónios maduros. Alterando dois parâmetros em relação a outros estudos, nomeadamente a taxa de aquisição em segundos e não bloquear a contração muscular, foi possível observar a formação de botões sinápticos in vivo e em tempo-real. Descobriu-se que a adição de botões pré-sinápticos em resposta a atividade aguda não ocorre como no período embrionário e não requer uma estrutura de crescimento especializada. Em vez disso, observou-se que os botões dependentes-da-atividade emergem de uma forma muito semelhante a um tipo de migração usado por algumas células na invasão de tecidos. Considerando que a junção neuromuscular não assenta apenas superficialmente no músculo, mas encaixa neste tecido, significa que os botões sinápticos estão embebidos no músculo. Assim, para que o neurónio motor forme botões funcionais é necessário que “invada” o músculo, o que não é muito diferente de mecanismos de migração através de outros tecidos. É possível que os neurónios motores tenham adotado uma estratégia em que combinam este mecanismo de migração com vias de sinalização dependentes-de-atividade para modular a adição de novos botões sinápticos durante a atividade muscular. Adicionalmente, observou-se a existência de uma elevada correlação entre a emergência de novos botões e a contração muscular, o que aponta para um possível papel mecânico do músculo durante este processo. Os vídeos analisados mostram pelo menos dois tipos de formação de botões: eventos rápidos associados com contração muscular intensa (“botão explosivo”) e fenómenos lentos que acompanham movimentos mais subtis (“botão gradual”). Notavelmente, ao manipular a via que regula este tipo de migração, possivelmente usado também pelos neurónios motores, expôs uma interação complexa entre os neurónios motores e o músculo na regulação do número de botões dependentes-da-atividade. Considerando a proximidade entre os dois tipos de células bem como as propriedades contractivas do músculo é plausível propor que a ação mecânica do músculo possa ter um papel ativo no neurónio motor para a formação de novos botões a partir de locais determinados ou mesmo acelerar o processo em situações de maior tensão. Sugere-se que a atividade do músculo pode ter um papel importante na modelação da frequência e dinâmica dos botões que emergem dos neurónios motores em resposta à atividade. Este estudo descreve um novo modo de crescimento neuronal, nomeadamente de formação de botões pré-sinápticos, que ainda não foi reportado em neurónios, mas que é bastante usado em migração em outros tipos celulares. De mencionar que as vias que levam à iniciação deste mecanismo são diversas sendo pouco provável que todas participem neste tipo de plasticidade, especialmente se o neurónio motor adaptar partes do mecanismo ou usar diferentes moléculas para atingir um resultado equivalente. Assim, o conhecimento dos genes ligados à formação de botões dependentes-da-atividade é necessário para compreender plenamente e de forma integrada o mecanismo de formação de botões num neurónio maduro. Por outro lado, este trabalho sugere que um balanço entre forças mecânicas e sinalização bioquímica são provavelmente coordenados durante a plasticidade estrutural em resposta a atividade muscular e expande a nossa compreensão dos mecanismos que regulam o crescimento e organização do terminal pré-sináptico. Uma análise mais aprofundada deste fenómeno, bem como das vias dependentes-da-atividade com papel no crescimento neuronal, irá contribuir para desvendar os princípios gerais que ligam o desenvolvimento e funcionamento normal à disfunção e à doença. Este conhecimento permitirá uma nova perceção e discernimento da etiologia da doença neuronal e o desenvolvimento de novas estratégias para promover a complexidade neuronal e possivelmente retardar os sintomas associados com doenças neuronais. | pt_PT |
| dc.identifier.tid | 201878828 | pt_PT |
| dc.identifier.uri | http://hdl.handle.net/10451/30577 | |
| dc.language.iso | eng | pt_PT |
| dc.subject | Botão pré-sináptico | pt_PT |
| dc.subject | Atividade | pt_PT |
| dc.subject | Plasticidade estrutural | pt_PT |
| dc.subject | Drosophila | pt_PT |
| dc.subject | Junção neuromuscular | pt_PT |
| dc.subject | Teses de mestrado - 2017 | pt_PT |
| dc.title | In vivo and in real-time mechanisms of synaptic bouton formation | pt_PT |
| dc.type | master thesis | |
| dspace.entity.type | Publication | |
| rcaap.rights | openAccess | pt_PT |
| rcaap.type | masterThesis | pt_PT |
| thesis.degree.name | Tese de mestrado em Biologia Molecular e Genética |