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Publication
Insights into the dynamics of methicillin-resistant staphylococci in animals : a focus on Staphylococcus pseudintermedius in dogs
| Name: | Description: | Size: | Format: | |
|---|---|---|---|---|
| 32.7 MB | Adobe PDF |
Authors
Abstract(s)
Staphylococci are a group of bacteria with clinical, agricultural, and economic importance because
of their wide range of virulence factors and ability to become resistant to antimicrobials.
This thesis has pursued three main objectives:
I. Determine the frequency of methicillin-resistant S. aureus (MRSA) strains in several
animal species, identify the characteristics of strains present in animals and comparison
with human strains
MRSA nasal screening was performed in 71 horses and 307 calves, and the observed frequencies
were 3% and 2%, respectively. Seventy-four MRSA isolated from 2001 to 2014
were characterized: fourteen spa types, three SCCmec types and three clonal complexes
(CC) 5, CC22 and CC398, were found. Most isolates were multidrug-resistant. Fourteen
MRSA CC398 strains had qac genes (13 qacG and 1 qacJ), while 4 isolates (three CC5 and
one CC22) had insertions in the norA promoter gene. MRSA linages from pets (CC5 and
CC22) harboured specific sets of virulence genes and a lower number of resistance genes
than CC398 from livestock-animals.
II. Reveal antimicrobial/biocide susceptibility patterns/trends and resistance genes in
methicillin-resistant staphylococci (MRS)
Several antimicrobial resistance patterns and genes were found in MRS from horses. Minimum
bactericidal concentrations of biocides chlorhexidine acetate, benzalkonium chloride,
triclosan and glutaraldehyde were lower than the recommended in-use concentrations for
veterinary medicine, although two MRS carried plasmid-borne qacA and sh-fabI or qacB and
qacH-like genes. An investigation on the evolution of resistance to 38 antimicrobials, corresponding
mechanisms and molecular characteristics of 644 clinical Staphylococcus spp. isolates
obtained from companion animals between 1999-2014 revealed resistance to the majority
of antimicrobials and the number of mecA-positive strains increased significantly over
time. Considering S. pseudintermedius, the methicillin-susceptible (MSSP) were genetically
more diverse than methicillin-resistant (MRSP). All MRSP and two MSSP strains were multidrug-
resistant, with several antimicrobial resistance genes identified. One MSSP isolate harbored
a qacA and another a qacB gene. Three biocide products had high bactericidal activity
(Otodine®, Clorexyderm Spot Gel®, Dermocanis Piocure-M®), while Skingel® failed to
achieve a five log reduction in the bacterial counting.
III. Study of the pathogenesis of S. pseudintermedius in dogs
The agr type III predominated in MRSP. Five virulence genes were found in all strains and
only spsO gene was significantly associated with MSSP. MSSP produced more biofilm on
BHIB and BHIB+1% glucose than MRSP isolates. Several virulence genes encoding surface
proteins and toxins were highly expressed in the MRSP strain (compared to MSSP). By
whole proteome characterization of S. pseudintermedius through 2DE MALDI-TOF/TOF MS
approach we were able to identify 367 unique proteins, of which 39 were surface proteins. By
subsequent use of the serological proteome analysis (SERPA) approach we identified 4 antigenic
proteins with promising features for vaccine development.
These results indicate that MRS were widely disseminated in the studied animal population,
the environment and people in contact with these animals. The resistant trends and mechanisms
detected in MRS strains are worrying and make animals a reservoir of important MRS
clones and genes. Biocides are still a good therapeutic choice, even in the presence of efflux
genes. Higher expression of virulence genes may play a role in the rapid and widespread of
MRSP clones. Dogs are able to mount an IgG-response against S. pseudintermedius and
the proteins identified by the immune system can in the future be used as vaccine candidates.
RESUMO - Estudo da dinâmica de estafilococos meticilina-resistente em animais – um foco no Staphylococcus pseudintermedius em cães - Os estafilococos são um grupo de bactérias com importância clínica, agrícola e económica devido à ampla gama de fatores de virulência e pela sua capacidade de se tornarem resistentes aos antimicrobianos. Esta tese debruçou-se sobre três objetivos principais: I. Determinar a frequência de estirpes S. aureus meticilina-resistente (MRSA) em diversas espécies animais, identificar as características das estirpes presentes em animais e comparar com estirpes humanas Colhemos zaragatoas de 71 cavalos e 307 vitelos para pesquisa de MRSA, e observaramse frequências de 3% e 2%, respetivamente. Foram caracterizadas setenta e quatro estirpes MRSA isoladas entre 2001-2014: catorze tipos de spa, três tipos de SCCmec e três complexos clonais (CC) 5, CC22 e CC398, foram encontrados. A maioria das estirpes (74%) eram multirresistentes. Catorze estirpes de MRSA CC398 tinha genes qac (13 qacG e 1 qacJ), enquanto 4 (três CC5 e um CC22) tinham inserções no gene promotor norA. As linhagens de MRSA de animais de estimação (CC5 e CC22) tinham conjuntos específicos de genes de virulência e um menor número de genes de resistência do que as linhagens associadas aos animais de produção (CC398). II. Revelar padrões/ tendências de suscetibilidade antimicrobiana/biocida e genes de resistência em estafilococos meticilina-resistente (MRS) Foram encontrados vários padrões e genes de resistência antimicrobiana em MRS de cavalos. As concentrações bactericidas mínimas dos biocidas acetato de clorhexidina, cloreto de benzalcónio, triclosan e glutaraldeído foram menores do que as recomendadas em medicina veterinária, embora dois MRS tivessem os genes plasmídicos qacA e sh-fabI ou qacB e um qacH-semelhante. Uma investigação sobre a evolução da resistência a 38 antimicrobianos, mecanismos correspondentes e características moleculares de 644 Staphylococcus spp. clínicos obtidos de animais de companhia entre 1999-2014 revelou resistência à maioria dos antimicrobianos. O número de estirpes mecA-positivo aumentou significativamente ao longo do tempo. Quanto aos S. pseudintermedius, os meticilina-suscetível (MSSP) eram geneticamente mais diversos do que os meticilina-resistente (MRSP). Todos os MRSP e 2 MSSP eram multirresistentes, com vários genes de resistência identificados. Um MSSP tinha um gene qacA e outro um qacB. Três produtos biocidas tinham elevada atividade bactericida (Otodine®, Clorexyderm Spot Gel®, Dermocanis Piocure-M®), enquanto Skingel® não conseguiu atingir uma redução de 5 log na contagem bacteriana. III. Estudo da patogenicidade de S. pseudintermedius em cães O tipo III agr predominou nos MRSP. Cinco genes de virulência foram encontrados em todas as estirpes e só o gene spsO foi significativamente associado com MSSP. MSSP produziu mais biofilme em BHIB e BHIB + 1% glucose que as estirpes de MRSP. Vários genes de virulência que codificam proteínas e toxinas de superfície foram altamente expressos na estirpe MRSP (em comparação com MSSP). Através da caracterização do proteoma total de S. pseudintermedius pela abordagem 2DE MALDI-TOF/TOF MS fomos capazes de identificar 367 proteínas únicas, das quais 39 eram proteínas de superfície. Posteriormente utilizámos a análise do proteoma serológico (SERPA) que identificou quatro proteínas antigénicas com características promissoras para o desenvolvimento de vacinas. Estes resultados indicam que MRS estavam amplamente disseminados na população animal estudada, no ambiente e nas pessoas em contato com esses animais. As tendências de resistência e os mecanismos detetados em estirpes MRS são preocupantes tornando os animais um reservatório de clones MRS e genes. Os biocidas ainda são uma boa opção terapêutica, mesmo na presença de bombas de efluxo. Uma maior expressão de genes de virulência pode desempenhar um papel na rápida expansão de clones de MRSP. Os cães foram capazes de montar uma resposta IgG contra S. pseudintermedius e as proteínas identificadas pelo sistema imunológico podem, no futuro, ser utilizadas como candidatos vacinais.
RESUMO - Estudo da dinâmica de estafilococos meticilina-resistente em animais – um foco no Staphylococcus pseudintermedius em cães - Os estafilococos são um grupo de bactérias com importância clínica, agrícola e económica devido à ampla gama de fatores de virulência e pela sua capacidade de se tornarem resistentes aos antimicrobianos. Esta tese debruçou-se sobre três objetivos principais: I. Determinar a frequência de estirpes S. aureus meticilina-resistente (MRSA) em diversas espécies animais, identificar as características das estirpes presentes em animais e comparar com estirpes humanas Colhemos zaragatoas de 71 cavalos e 307 vitelos para pesquisa de MRSA, e observaramse frequências de 3% e 2%, respetivamente. Foram caracterizadas setenta e quatro estirpes MRSA isoladas entre 2001-2014: catorze tipos de spa, três tipos de SCCmec e três complexos clonais (CC) 5, CC22 e CC398, foram encontrados. A maioria das estirpes (74%) eram multirresistentes. Catorze estirpes de MRSA CC398 tinha genes qac (13 qacG e 1 qacJ), enquanto 4 (três CC5 e um CC22) tinham inserções no gene promotor norA. As linhagens de MRSA de animais de estimação (CC5 e CC22) tinham conjuntos específicos de genes de virulência e um menor número de genes de resistência do que as linhagens associadas aos animais de produção (CC398). II. Revelar padrões/ tendências de suscetibilidade antimicrobiana/biocida e genes de resistência em estafilococos meticilina-resistente (MRS) Foram encontrados vários padrões e genes de resistência antimicrobiana em MRS de cavalos. As concentrações bactericidas mínimas dos biocidas acetato de clorhexidina, cloreto de benzalcónio, triclosan e glutaraldeído foram menores do que as recomendadas em medicina veterinária, embora dois MRS tivessem os genes plasmídicos qacA e sh-fabI ou qacB e um qacH-semelhante. Uma investigação sobre a evolução da resistência a 38 antimicrobianos, mecanismos correspondentes e características moleculares de 644 Staphylococcus spp. clínicos obtidos de animais de companhia entre 1999-2014 revelou resistência à maioria dos antimicrobianos. O número de estirpes mecA-positivo aumentou significativamente ao longo do tempo. Quanto aos S. pseudintermedius, os meticilina-suscetível (MSSP) eram geneticamente mais diversos do que os meticilina-resistente (MRSP). Todos os MRSP e 2 MSSP eram multirresistentes, com vários genes de resistência identificados. Um MSSP tinha um gene qacA e outro um qacB. Três produtos biocidas tinham elevada atividade bactericida (Otodine®, Clorexyderm Spot Gel®, Dermocanis Piocure-M®), enquanto Skingel® não conseguiu atingir uma redução de 5 log na contagem bacteriana. III. Estudo da patogenicidade de S. pseudintermedius em cães O tipo III agr predominou nos MRSP. Cinco genes de virulência foram encontrados em todas as estirpes e só o gene spsO foi significativamente associado com MSSP. MSSP produziu mais biofilme em BHIB e BHIB + 1% glucose que as estirpes de MRSP. Vários genes de virulência que codificam proteínas e toxinas de superfície foram altamente expressos na estirpe MRSP (em comparação com MSSP). Através da caracterização do proteoma total de S. pseudintermedius pela abordagem 2DE MALDI-TOF/TOF MS fomos capazes de identificar 367 proteínas únicas, das quais 39 eram proteínas de superfície. Posteriormente utilizámos a análise do proteoma serológico (SERPA) que identificou quatro proteínas antigénicas com características promissoras para o desenvolvimento de vacinas. Estes resultados indicam que MRS estavam amplamente disseminados na população animal estudada, no ambiente e nas pessoas em contato com esses animais. As tendências de resistência e os mecanismos detetados em estirpes MRS são preocupantes tornando os animais um reservatório de clones MRS e genes. Os biocidas ainda são uma boa opção terapêutica, mesmo na presença de bombas de efluxo. Uma maior expressão de genes de virulência pode desempenhar um papel na rápida expansão de clones de MRSP. Os cães foram capazes de montar uma resposta IgG contra S. pseudintermedius e as proteínas identificadas pelo sistema imunológico podem, no futuro, ser utilizadas como candidatos vacinais.
Description
Tese especialmente elaborada para a obtenção do grau de Doutor em Ciências Veterinárias, especialidade de Clínica
Keywords
mecA staphylococci methicillin-resistance animals vaccine estafilococos resistência à meticilina animais vacina
Pedagogical Context
Citation
Couto, N.M.G. (2016). Insights into the dynamics of methicillin-resistant staphylococci in animals : a focus on Staphylococcus pseudintermedius in dogs. Tese de Doutoramento. Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina Veterinária, Lisboa.
Publisher
Universidade de Lisboa. Faculdade de Medicina Veterinária