A carregar...
Publicação
Severe sepsis : protective role of epirubicin
| Nome: | Descrição: | Tamanho: | Formato: | |
|---|---|---|---|---|
| 16.36 MB | Adobe PDF |
Autores
Resumo(s)
Sepsis remains a poorly understood systemic inflammatory condition with high mortality rates and limited therapeutic options in addition to organ support measures. Most often, this syndrome is triggered by a bacterial infection that causes excessive production of pro-inflammatory mediators, including the initial critical tumor necrosis factor (TNF) and interleukin 1β (IL-1β), leading to the activation of spiraling signaling cascades ultimately causing multi-organ failure and death. To find compounds that modulate the systemic inflammatory response syndrome, we performed an in vitro drug screen aiming at identifying pharmacologic agents that could simultaneously inhibit the secretion of two key initiators of sepsis: TNF and IL-1β. Our attention was directed to the clinically approved group of anthracyclines, because in the top 20 of selected candidates, we found 3 representative agents of this group: epirubicin, doxorubicin and daunorubicin. This drug screen has also identified additional anti-inflammatory drugs that have been further studied by our collaborators. For instance, gambogic acid and celastrol are currently being tested as treatment adjuncts in auto-immune arthritis models. In vivo, we have observed that anthracyclines confer protection against severe sepsis induced by cecal ligation and puncture (CLP), a murine model of peritonitis. The protective effect of epirubicin decreases tissue damage in the target organs (liver, lung and kidney) and dampens the circulating pro-inflammatory mediators such as TNF, IL-1β and IL-6. This is also true for late inflammatory mediators like HMGB1, which is lower in the plasma and in the tissues. Epirubicin is effective in other inflammatory models such as endotoxemia (induced by intraperitoneal LPS injection) and monostrain pulmonary infection (elicited by intra-nasal inhalation of bacteria). Anthracyclines induce disease tolerance to infection (an increased capacity to cope with the same pathogen burden), as demonstrated by similar CFU counts in blood, spleen and target organs between the treated and non-treated groups. Additionally, this is supported by the fact that broad-spectrum antibiotic treatment delays mortality in CLP but does not preclude it, compared to epirubicin treatment. Using an shRNA-based screen we identified the Ataxia Telangiectasia Mutated (ATM) as a mediator of the protective effect of anthracyclines. ATM deficient (Atm-/-) mice are refractory to this protective effect succumbing to severe sepsis with similar kinetics to the non-treated wild-type mice. This protective effect relies on the activation of a DNA damage response and the autophagy pathway specifically in the lung, as demonstrated by deletion of the ATM or the autophagy-related protein 7 (Atg7) specifically in this organ. Importantly, epirubicin specifically induces LC3b lipidation (a marker for autophagy activation) in the lung, a response that is low or absent in this organ in the absence of anthracycline treatment, but occurs spontaneously and transiently in the liver and also in the kidney, by sepsis induction alone. According to the above mentioned, we propose that lung protection is an early priority in sepsis management. These results support the hypothesis that ATM acts in mediating the induction of autophagy by epirubicin, which is critical for the protection conferred by this drug in the septic model that we investigated. Our work has identified several original pharmacologic actions of anthracyclines, and particularly epirubicin: dampen inflammation; scavenge ROS; induce organ protection through the autophagy pathway. Together, these features might confer a useful addition to the standard of care treatments for septic patients. We have further investigated the immune-suppressive phase that ensues sepsis and found that epirubicin treated mice are not immune-depressed with the used doses. This observation supports epirubicin use in the clinical setting of septic syndromes. Our research suggests that epirubicin has a useful therapeutic window in sepsis. If anthracyclines are administered in combination with a broad-spectrum antibiotic such as meropenem, they protect from CLP mortality even if they are given only 24 hours after the initial procedure, provided meropenem is administered within the initial 12 hours after CLP. The 24-hour therapeutic window that we tested might be sufficient to make this drug useful in the clinical setting. Especially to reduce organ dysfunction (and probably mortality) from sepsis in most patients who are either in the hospital or seek medical attention within the first few hours of symptoms initiation. Under conditions that reflect the human standard of care of this pathology, epirubicin and more generally the group of anthracyclines may be effective at preventing mortality due to sepsis. An additional important result of our work is the identification of ATM as a novel negative regulator of the inflammatory response and a critical determinant for inducing tolerance to the burden of infection, making it an attractive molecular target for novel therapies for inflammation-driven conditions.
A sépsis é uma doença inflamatória sistémica cujos mecanismos moleculares ainda se encontram mal compreendidos. A sua elevada mortalidade é condicionada pelas poucas opções terapêuticas disponíveis, que não vão além de medidas de suporte de órgão em ambiente de unidade de cuidados intensivos. A sépsis é frequentemente iniciada por uma infecção bacteriana, que por sua vez origina uma produção excessiva de mediadores pró-inflamatórios. No conjunto das citocinas pró-inflamatórias, o Factor de Necrose Tumoral (TNF) e a Interleucina 1β (IL-1β) são consideradas os mediadores críticos, nas primeiras horas deste processo. A libertação destas citocinas, pelas células efectoras do sistema imunitário, leva à activação descontrolada de vias de sinalização que podem ser responsáveis pela disfunção de vários órgãos, condicionando em última análise a morte do doente. Iniciámos o nosso projecto de investigação por um "rastreio" farmacológico in vitro, com o objectivo de identificar compostos que inibissem simultaneamente os mediadores-chave neste síndrome: o TNF e a IL-1β. Deste modo, tentámos seleccionar drogas que modulassem o síndrome de resposta inflamatória sistémica. Um dos nossos melhores candidatos foi o grupo farmacológico das antraciclinas. Estes fármacos encontram-se aprovados, para uso clínico em doentes oncológicos, há já vários anos. Nos melhores 20 candidatos, observámos 3 compostos representantes deste grupo: a epirrubicina, a doxorrubicina e daunorrubicina. O nosso "rastreio" farmacológico também identificou outros compostos anti-inflamatórios que estão actualmente a ser estudados por outros investigadores deste laboratório. A título de exemplo, o ácido gambógico e o celastrol estão actualmente a ser testados como agentes terapêuticos em modelos animais de artrite autoimune, com resultados muito positivos. In vivo, observámos que as antraciclinas possuem um efeito protector no modelo de peritonite grave em ratinho: a laqueação e perfuração do cego (CLP). A protecção conferida pela epirrubicina diminui a lesão tecidual nos órgãos mais afectados pela sépsis (fígado, pulmão e rim) e diminui os mediadores inflamatórios circulantes (TNF, IL-1β e IL-6). Este efeito verifica-se também nos mediadores pró-inflamatórios de libertação tardia, como demonstrado pela diminuição do HMGB1, quer em circulação, quer nos tecidos. A epirrubicina é também protectora noutros modelos inflamatórios, como o da endotoxémia (induzido pela injecção intraperitoneal de LPS) e o de pneumonia bacteriana (provocado pela inalação de uma estirpe bacteriana). As antraciclinas induzem tolerância à infecção (uma capacidade superior para suportar a mesma dose de patogéneos), conforme se pode demonstrar pelas contagens semelhantes de bactérias (CFUs) em circulação, no baço e nos órgãos alvo (fígado e rins), em animais sujeitos a CLP, entre os grupos tratados com epirrubicina e os não tratados. Além do atrás exposto, verifica-se que o tratamento com antibiótico de largo espectro, comparativamente ao tratamento com epirrubicina, atrasa a mortalidade na sépsis grave mas não a impede. Através de um novo "rastreio" genético, in vitro, utilizando tecnologia com shRNA, identificámos o gene Ataxia Telangiectasia Mutated (ATM) como sendo o mediador deste efeito protector das antraciclinas. Os ratinhos deficientes neste gene (Atm-/-) são resistentes a este efeito protector e morrem com uma cinética semelhante aos ratinhos controlo não tratados com epirrubicina. Ratinhos Atm-/-, tratados com epirrubicina, apresentam lesão de órgão e mediadores pró-inflamatórios semelhantes aos não tratados. Este efeito protector das antraciclinas parece depender da activação de uma resposta reparadora de lesões do DNA e da via da autofagia. Este mecanismo é sobretudo importante no pulmão, como demonstramos pela remoção selectiva e específica do gene ATM, ou da proteína envolvida no processo de autofagia ATG7, no tecido pulmonar de ratinhos. A epirrubicina induz especificamente a lipidação da proteína LC3b (marcador de activação da via da autofagia) no pulmão. Na ausência de qualquer tratamento com antraciclinas, esta resposta não se verifica neste órgão, mas ocorre espontaneamente e transitoriamente no fígado e rins de animais apenas submetidos a sépsis grave. As nossas observações levam-nos a propor que a protecção do pulmão e da função respiratória são uma prioridade fulcral no tratamento da sépsis grave e do choque séptico. No modelo animal de sépsis grave e choque séptico, os nossos resultados suportam a hipótese de que a indução da autofagia, mediada pelo ATM, é um dos mecanismos críticos do efeito protector da epirrubicina. Os resultados do nosso trabalho evidenciaram novos efeitos farmacológicos das antraciclinas, e particularmente da epirrubicina: composto anti-inflamatório; captador e quelante de radicais livres de oxigénio; protector da lesão de órgão pela indução da via da autofagia. Em conjunto, estas características podem adicionar alguma vantagem, à melhor terapêutica instituída, no contexto do tratamento de doentes sépticos. Investigámos ainda a fase de imunossupressão que se segue à fase pró-inflamatória na sépsis. Observámos que a epirrubicina, nas doses utilizadas, não agrava a imunodepressão característica deste período. Este resultado suporta o seu potencial uso clínico nos síndromes sépticos. A nossa investigação no modelo animal sugere que a epirrubicina pode actuar numa janela terapêutica. As antraciclinas têm ainda um efeito protector, mesmo que só administradas 24 horas depois do início do quadro séptico, desde que associadas a um antibiótico de largo espectro (como o meropenem). A janela terapêutica que testámos (24 horas) poderá ser suficiente para tornar esta droga útil no contexto clínico. Especialmente quando utilizada com o objectivo de reduzir lesão de órgão (ou mesmo a mortalidade), em doentes que se encontram internados no hospital, ou que procuram assistência médica nas primeiras horas após o início dos sintomas. Em humanos, a epirrubicina poderá ser eficaz na prevenção da mortalidade induzida pela sépsis, quando associada à melhor terapêutica disponível, habitualmente administrada no tratamento desta patologia. Os nossos resultados identificaram ainda o gene ATM como um novo regulador negativo da resposta inflamatória e um determinante crítico na indução da tolerância à infecção. Estas características tornam-no num potencial alvo de terapêutica molecular em situações clínicas de causa inflamatória.
A sépsis é uma doença inflamatória sistémica cujos mecanismos moleculares ainda se encontram mal compreendidos. A sua elevada mortalidade é condicionada pelas poucas opções terapêuticas disponíveis, que não vão além de medidas de suporte de órgão em ambiente de unidade de cuidados intensivos. A sépsis é frequentemente iniciada por uma infecção bacteriana, que por sua vez origina uma produção excessiva de mediadores pró-inflamatórios. No conjunto das citocinas pró-inflamatórias, o Factor de Necrose Tumoral (TNF) e a Interleucina 1β (IL-1β) são consideradas os mediadores críticos, nas primeiras horas deste processo. A libertação destas citocinas, pelas células efectoras do sistema imunitário, leva à activação descontrolada de vias de sinalização que podem ser responsáveis pela disfunção de vários órgãos, condicionando em última análise a morte do doente. Iniciámos o nosso projecto de investigação por um "rastreio" farmacológico in vitro, com o objectivo de identificar compostos que inibissem simultaneamente os mediadores-chave neste síndrome: o TNF e a IL-1β. Deste modo, tentámos seleccionar drogas que modulassem o síndrome de resposta inflamatória sistémica. Um dos nossos melhores candidatos foi o grupo farmacológico das antraciclinas. Estes fármacos encontram-se aprovados, para uso clínico em doentes oncológicos, há já vários anos. Nos melhores 20 candidatos, observámos 3 compostos representantes deste grupo: a epirrubicina, a doxorrubicina e daunorrubicina. O nosso "rastreio" farmacológico também identificou outros compostos anti-inflamatórios que estão actualmente a ser estudados por outros investigadores deste laboratório. A título de exemplo, o ácido gambógico e o celastrol estão actualmente a ser testados como agentes terapêuticos em modelos animais de artrite autoimune, com resultados muito positivos. In vivo, observámos que as antraciclinas possuem um efeito protector no modelo de peritonite grave em ratinho: a laqueação e perfuração do cego (CLP). A protecção conferida pela epirrubicina diminui a lesão tecidual nos órgãos mais afectados pela sépsis (fígado, pulmão e rim) e diminui os mediadores inflamatórios circulantes (TNF, IL-1β e IL-6). Este efeito verifica-se também nos mediadores pró-inflamatórios de libertação tardia, como demonstrado pela diminuição do HMGB1, quer em circulação, quer nos tecidos. A epirrubicina é também protectora noutros modelos inflamatórios, como o da endotoxémia (induzido pela injecção intraperitoneal de LPS) e o de pneumonia bacteriana (provocado pela inalação de uma estirpe bacteriana). As antraciclinas induzem tolerância à infecção (uma capacidade superior para suportar a mesma dose de patogéneos), conforme se pode demonstrar pelas contagens semelhantes de bactérias (CFUs) em circulação, no baço e nos órgãos alvo (fígado e rins), em animais sujeitos a CLP, entre os grupos tratados com epirrubicina e os não tratados. Além do atrás exposto, verifica-se que o tratamento com antibiótico de largo espectro, comparativamente ao tratamento com epirrubicina, atrasa a mortalidade na sépsis grave mas não a impede. Através de um novo "rastreio" genético, in vitro, utilizando tecnologia com shRNA, identificámos o gene Ataxia Telangiectasia Mutated (ATM) como sendo o mediador deste efeito protector das antraciclinas. Os ratinhos deficientes neste gene (Atm-/-) são resistentes a este efeito protector e morrem com uma cinética semelhante aos ratinhos controlo não tratados com epirrubicina. Ratinhos Atm-/-, tratados com epirrubicina, apresentam lesão de órgão e mediadores pró-inflamatórios semelhantes aos não tratados. Este efeito protector das antraciclinas parece depender da activação de uma resposta reparadora de lesões do DNA e da via da autofagia. Este mecanismo é sobretudo importante no pulmão, como demonstramos pela remoção selectiva e específica do gene ATM, ou da proteína envolvida no processo de autofagia ATG7, no tecido pulmonar de ratinhos. A epirrubicina induz especificamente a lipidação da proteína LC3b (marcador de activação da via da autofagia) no pulmão. Na ausência de qualquer tratamento com antraciclinas, esta resposta não se verifica neste órgão, mas ocorre espontaneamente e transitoriamente no fígado e rins de animais apenas submetidos a sépsis grave. As nossas observações levam-nos a propor que a protecção do pulmão e da função respiratória são uma prioridade fulcral no tratamento da sépsis grave e do choque séptico. No modelo animal de sépsis grave e choque séptico, os nossos resultados suportam a hipótese de que a indução da autofagia, mediada pelo ATM, é um dos mecanismos críticos do efeito protector da epirrubicina. Os resultados do nosso trabalho evidenciaram novos efeitos farmacológicos das antraciclinas, e particularmente da epirrubicina: composto anti-inflamatório; captador e quelante de radicais livres de oxigénio; protector da lesão de órgão pela indução da via da autofagia. Em conjunto, estas características podem adicionar alguma vantagem, à melhor terapêutica instituída, no contexto do tratamento de doentes sépticos. Investigámos ainda a fase de imunossupressão que se segue à fase pró-inflamatória na sépsis. Observámos que a epirrubicina, nas doses utilizadas, não agrava a imunodepressão característica deste período. Este resultado suporta o seu potencial uso clínico nos síndromes sépticos. A nossa investigação no modelo animal sugere que a epirrubicina pode actuar numa janela terapêutica. As antraciclinas têm ainda um efeito protector, mesmo que só administradas 24 horas depois do início do quadro séptico, desde que associadas a um antibiótico de largo espectro (como o meropenem). A janela terapêutica que testámos (24 horas) poderá ser suficiente para tornar esta droga útil no contexto clínico. Especialmente quando utilizada com o objectivo de reduzir lesão de órgão (ou mesmo a mortalidade), em doentes que se encontram internados no hospital, ou que procuram assistência médica nas primeiras horas após o início dos sintomas. Em humanos, a epirrubicina poderá ser eficaz na prevenção da mortalidade induzida pela sépsis, quando associada à melhor terapêutica disponível, habitualmente administrada no tratamento desta patologia. Os nossos resultados identificaram ainda o gene ATM como um novo regulador negativo da resposta inflamatória e um determinante crítico na indução da tolerância à infecção. Estas características tornam-no num potencial alvo de terapêutica molecular em situações clínicas de causa inflamatória.
Descrição
Tese de doutoramento, Medicina (Cirurgia Geral), Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2013
Palavras-chave
Sépsis Choque séptico Epirubicina Insuficiência de múltiplos órgãos Antraciclinas Teses de doutoramento - 2013