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Authors
Abstract(s)
Uma vez que as terapias clínicas atuais para promover a reparação e regeneração óssea (tais como enxertos ósseos e materiais substitutos de osso) não são suficientemente bem-sucedidas, uma pesquisa significativa no campo da Engenharia de Tecidos tem sido desenvolvida para superar as limitações existentes. As abordagens da Engenharia de Tecido Ósseo procuram reproduzir o papel dos enxertos ósseos naturais, e baseiam-se na estimulação da formação de osso através do uso de células em combinação com um scaffold biomaterial. Scaffolds são estruturas biocompatíveis tridimensionais (3D) que procuram imitar as propriedades da matriz extracelular (ECM), servindo de estrutura temporária para a adesão, proliferação e diferenciação celular, como também para a formação de ECM, fornecendo suporte estrutural para o tecido recém-formado. Lesões ósseas geralmente resultam em infecção. Scaffolds podem fornecer uma estrutura para a regeneração óssea, bem como um substrato para a incorporação de antibióticos. Estes podem ser projetados para libertar o medicamento de forma controlada, a fim de prevenir ou combater infecções localmente, evitando os efeitos adversos da terapia antibiótica sistémica. Várias estratégias têm sido desenvolvidas para permitir um perfil de libertação do fármaco controlado, procurando um equilíbrio ideal entre o fornecimento de antibióticos e a regeneração do tecido. Uma estratégia interessante é utilizar um composto inorgânico capaz de conter e proteger moléculas ativas, permitindo uma libertação lenta e controlada em condições selecionadas. A fluoroquinolona mais utilizada no tratamento da infecção óssea bacteriana é a ciprofloxacina (CFX), devido à sua excelente biodisponibilidade oral e penetração óssea. A gentamicina (GTM) é o antibiótico mais estudado como aditivo a cimentos ósseos, devido ao seu amplo espectro de ação e boa termoestabilidade. Esta dissertação teve como objetivo produzir, através de uma técnica de fabricação aditiva, scaffolds poliméricos 3D que contêm fillers inorgânicos bioativos com antibióticos intercalados. Teve também como objetivo caracterizar estes scaffolds e analizar as interações de células estaminais mesenquimais humanas (hMSCs) com estes. Os scaffolds foram fabricados através de uma técnica de fused deposition modelling (FDM). A matriz polimérica do material utilizado é constituída por PEOT/PBT. Os fillers MgAl based layered double hydroxide (LDH) ou α-fosfato de zircónio (ZrP), contendo os antibióticos CFX ou GTM intercalados, respectivamente, foram dispersos entre a matriz polimérica. Em particular, o foco desta dissertação foi entender como diferentes concentrações de fillers (e consequentemente, diferentes concentrações de antibióticos) influenciam a cinética de libertação dos antibióticos do scaffold, a distribuição dos fillers na matriz polimérica, o ângulo de contato dos materiais, os parâmetros de impressão, a morfologia dos scaffolds, as interações entre as células e os materiais e a diferenciação celular. Para tal, utilizou-se PEOT/PBT carregado com diferentes concentrações de fillers, e PEOT/PBT puro serviu como amostra de controlo. As experiências foram divididas em análise 2D (filmes como amostras) e 3D (scaffolds como amostras) dos materiais. Para complementar estes estudos, a toxicidade dos antibióticos para hMSCs foi determinada e um estudo mostrou que a exposição dos antibióticos a uma temperatura tão alta quanto a temperatura de impressão não compromete sua detecção. O ângulo de contato mostrou que a presença de fillers na matriz polimérica torna o material mais hidrofílico. Os scaffolds foram fabricados com sucesso, e a sua morfologia foi considerada satisfatória. Imagens dos filmes e scaffolds obtidas com o scanning electron microscope (SEM) permitiram analisar a distribuição dos fillers na matriz polimérica. O estudo da cinética de libertação de CFX e GTM mostrou que os perfis de libertação dos dois antibióticos são diferentes entre si, provavelmente devido à natureza da filler e, portanto, ao mecanismo do processo de desintercalação. As curvas dos perfis de libertação de antibiótico são semelhantes entre filmes e scaffolds do mesmo material, no entanto a libertação de CFX é maior nos scaffolds do que nos filmes, e a libertação de GTM é maior nos filmes do que nos scaffolds. Diferentes hipóteses são propostas para explicar estes resultados. As interações entre células e materiais em amostras 2D sugerem que os materiais utilizados neste estudo são biocompatíveis e constituem um substrato de cultura viável para hMSCs. Os estudos sugerem que a presença de fillers e a libertação de antibióticos não afetam a adesão, proliferação e atividade metabólica celular. De acordo com o estudo de toxicidade, foi possível deduzir que o antibiótico libertado no meio durante a cultura não alcançou concentrações consideradas tóxicas para as células. Além disso, as colorações do citoesqueleto das células mostraram que a propriedade hidrofílica que os fillers fornecem ao material parece melhorar o alastramento de hMSCs. As interações entre células e materiais em amostras 3D sugerem que a adesão das células MG63 aos scaffolds e a sua proliferação foram bem-sucedidas. As colorações do citoesqueleto das células confirmaram qualitativamente que a infiltração celular nos scaffolds foi bem-sucedida e as células sobreviveram ao longo dos sete dias. As interações entre células e materiais em amostras 3D com hMSCs e o estudo de diferenciação osteogénica foram realizados com os scaffolds ZrP-GTM_PEOT/PBT. Devido a uma adesão celular não homogénea nos scaffolds, esta experiência é considerada apenas preliminar. Em todos os scaffolds, hMSCs aderiram e sobreviveram durante 29 dias em meio básico ou em meio de mineralização. Concentrações elevadas de GTM libertada em scaffolds 20ZrP-GTM_PEOT/PBT, durante as 4h de adesão celular, sugerem afetar a adesão de hMSCs. No entanto, estas sobreviveram, o que significa que a viabilidade celular não parece ser comprometida a longo prazo. O estudo da atividade da fosfatase alcalina (ALP) indicou que os scaffolds em meio de mineralização permitiram que as células se diferenciassem na linhagem osteogénica, pelo que a presença de fillers e a libertação de GTM não impediram este fenómeno. A coloração com Alizarin Red indicou que os scaffolds 5ZrPGTM_PEOT/PBT em meio de mineralização mostraram mineralização da matriz após 29 dias de cultura, sugerindo que estes scaffolds podem ser considerados candidatos para a regeneração óssea. Além de esclarecer os erros nas experiências realizadas, trabalho futuro desta dissertação envolve a investigação das interações entre células e materiais, bem como a diferenciação osteogénica, de hMSCs em scaffolds LDH-CFX_PEOT/PBT, o que não foi realizado neste trabalho. Colorações do citoesqueleto para confirmar qualitativamente a infiltração de hMSCs nos scaffolds seria também importante para completar essa análise. É relevante notar que este estudo carece de scaffolds com apenas fillers (LDH_PEOT/PBT e ZrP_PEOT/PBT, sem antibióticos) como amostras de controlo, a fim de distinguir o efeito dos fillers na superfície das amostras do efeito da libertação do antibiótico. Estudos antibacterianos serão fundamentais para confirmar que a alta temperatura de impressão não degrada os antibióticos, e que sua atividade antibacteriana é preservada. Mais importante ainda, estes estudos permitirão analisar o efeito da libertação lenta e controlada dos antibióticos intercalados nos fillers. Assim, será investigado se um nível adequado de concentração terapêutica pode ser conseguido. Projetar um scaffold com um perfil de libertação controlada de antibiótico, capaz de alcançar um equilíbrio ideal entre o fornecimento local de antibióticos e a regeneração do tecido, tem claramente um grande potencial. Têm sido feitos progressos significativos nesta área, e vários scaffolds 3D bioactivos foram desenvolvidos para serem potencialmente usados como portadores de fármacos para a regeneração óssea. No entanto, a busca pela combinação perfeita de características do scaffold continua, e a validação in vivo destas tecnologias ainda está num estágio inicial. Vários desafios ainda precisam de ser resolvidos para que a Engenharia de Tecido Ósseo possa tornar-se uma realidade clínica.
Since current clinical therapies to promote bone repair and regeneration (such as bone grafts and bone substitute materials) have not been sufficiently successful, significant research in the field of Tissue Engineering has been developed to overcome the existing limitations. Bone Tissue Engineering (BTE) approaches attempt to mimic the role of natural bone grafts, and are based on stimulating bone formation through the use of cells in combination with a biomaterial scaffold. Bone injuries often lead to bone infection. Scaffolds can provide a framework for bone regeneration as well as a substrate for the incorporation of antimicrobial agents. Scaffolds can be designed to release the drug in a controlled manner, in order to prevent or combat infections at the local site, avoiding adverse effects of systemic antibiotic therapy. Several strategies have been developed to permit a controlled drug release profile, seeking an optimal balance between antimicrobial delivery and regenerative therapeutics. An interesting strategy is to entrap active molecules into an inorganic compound able to hold and protect them, allowing a slow and controlled release in selected conditions. This thesis aimed at the production and characterization of three dimensional (3D) additive manufactured (AM) polymeric scaffolds containing bioactive inorganic fillers with intercalated antibiotics, as well as the analysis of the interactions of human mesenchymal stem cells (hMSCs) with these scaffolds. Within the PEOT/PBT matrix, the fillers MgAl based layered double hydroxide (LDH) or α-zirconium phosphate (ZrP), containing intercalated ciprofloxacin (CFX) or gentamicin (GTM), respectively, were dispersed. In particular, the focus of the thesis was to understand how different concentrations of inorganic fillers (and consequently, different concentrations of antibiotics) influence the scaffold’s antibiotics release kinetics, filler distribution within the polymer matrix, materials’ contact angle, printing parameters, scaffold’s morphology, cell-material interactions and cell differentiation. LDH-CFX_PEOT/PBT and ZrP-GTM_PEOT/PBT scaffolds, with different wt% of filler, were successfully fabricated using a fused deposition modelling (FDM) technique. Staining pictures qualitatively confirmed that cell infiltration into the scaffolds was successful. 2D cell studies suggested that the materials used in this study are biocompatible and constitute a feasible culture substrate for hMSCs. Moreover, showed that the hydrophilic property that the fillers provide to the material seem to improve the spread of hMSCs. The CFX and GTM release study showed that the release profiles of the two antibiotics look very different, however similar between films and scaffolds of the same material. Also, the release curves suggested that the antibiotic released corresponds to the one present in the fillers in the surface of the samples. ZrP-GTM_PEOT/PBT scaffolds in mineralization media allowed hMSCs to differentiate into the osteogenic lineage, as shown by ALP (alkaline phosphatase) activity profiles. 5ZrP-GTM_PEOT/PBT scaffolds showed matrix mineralization after 29 days of culture, suggesting that these scaffolds can be considered as candidates for bone regeneration.
Since current clinical therapies to promote bone repair and regeneration (such as bone grafts and bone substitute materials) have not been sufficiently successful, significant research in the field of Tissue Engineering has been developed to overcome the existing limitations. Bone Tissue Engineering (BTE) approaches attempt to mimic the role of natural bone grafts, and are based on stimulating bone formation through the use of cells in combination with a biomaterial scaffold. Bone injuries often lead to bone infection. Scaffolds can provide a framework for bone regeneration as well as a substrate for the incorporation of antimicrobial agents. Scaffolds can be designed to release the drug in a controlled manner, in order to prevent or combat infections at the local site, avoiding adverse effects of systemic antibiotic therapy. Several strategies have been developed to permit a controlled drug release profile, seeking an optimal balance between antimicrobial delivery and regenerative therapeutics. An interesting strategy is to entrap active molecules into an inorganic compound able to hold and protect them, allowing a slow and controlled release in selected conditions. This thesis aimed at the production and characterization of three dimensional (3D) additive manufactured (AM) polymeric scaffolds containing bioactive inorganic fillers with intercalated antibiotics, as well as the analysis of the interactions of human mesenchymal stem cells (hMSCs) with these scaffolds. Within the PEOT/PBT matrix, the fillers MgAl based layered double hydroxide (LDH) or α-zirconium phosphate (ZrP), containing intercalated ciprofloxacin (CFX) or gentamicin (GTM), respectively, were dispersed. In particular, the focus of the thesis was to understand how different concentrations of inorganic fillers (and consequently, different concentrations of antibiotics) influence the scaffold’s antibiotics release kinetics, filler distribution within the polymer matrix, materials’ contact angle, printing parameters, scaffold’s morphology, cell-material interactions and cell differentiation. LDH-CFX_PEOT/PBT and ZrP-GTM_PEOT/PBT scaffolds, with different wt% of filler, were successfully fabricated using a fused deposition modelling (FDM) technique. Staining pictures qualitatively confirmed that cell infiltration into the scaffolds was successful. 2D cell studies suggested that the materials used in this study are biocompatible and constitute a feasible culture substrate for hMSCs. Moreover, showed that the hydrophilic property that the fillers provide to the material seem to improve the spread of hMSCs. The CFX and GTM release study showed that the release profiles of the two antibiotics look very different, however similar between films and scaffolds of the same material. Also, the release curves suggested that the antibiotic released corresponds to the one present in the fillers in the surface of the samples. ZrP-GTM_PEOT/PBT scaffolds in mineralization media allowed hMSCs to differentiate into the osteogenic lineage, as shown by ALP (alkaline phosphatase) activity profiles. 5ZrP-GTM_PEOT/PBT scaffolds showed matrix mineralization after 29 days of culture, suggesting that these scaffolds can be considered as candidates for bone regeneration.
Description
Tese de mestrado integrado, Engenharia Biomédica e Biofísica, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2019
Keywords
Engenharia de tecido ósseo Fabricação aditiva hMSCs Libertação local e controlada de antibiótico Filler inorgânico bioactivo Teses de mestrado - 2019