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Publicação
The role of β-Hydroxybutyrate on the energetic homeostasis of synapses and neurons
| Nome: | Descrição: | Tamanho: | Formato: | |
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Orientador(es)
Resumo(s)
O cérebro é conhecido por ser um órgão com uma exigência energética muito alta. Para satisfazer esta necessidade, o cérebro utiliza glucose como fonte principal de energia. No entanto, o cérebro tem a capacidade de adaptar o seu metabolismo durante condições de baixos níveis de glucose, usando outros substratos para produção de ATP, como é o caso dos corpos cetónicos. Os corpos cetónicos são moléculas pequenas e solúveis em água, derivadas do metabolismo dos ácidos gordos. Eles são sintetizados praticamente em exclusivo no jgado durante períodos de níveis reduzidos de glucose no sangue, como por exemplo, em períodos de jejum ou através de uma dieta pobre em hidratos de carbono (Dieta cetogénica). O corpo cetónico mais abundantemente identificado no sangue designa-se por β-hidroxibutirato (β- HB). Este substrato é relevante para o sistema nervoso, visto que pode ser metabolizado pelas mitocôndrias neuronais, produzindo acetil-Coenzima A, que por sua vez, atua como um substrato no ciclo do ácido cítrico, resultando na produção de ATP por meio do processo de fosforilação oxidativa. Nos neurónios, as mitocôndrias localizadas nas sinapses, denominadas mitocôndrias sinápticas, têm um perfil bioquímico específico e distinto que se adequa ao ambiente exigente onde se localizam. Especificamente, a região sináptica é conhecida por ser um ambiente no qual existe uma necessidade energética muito intensa, visto que uma grande quantidade de ATP é necessária para manter os potenciais de membrana neuronal e permitir a comunicação entre os neurónios. Nesse sentido, o laboratório anfitrião realizou uma análise proteómica com o objetivo de comparar o perfil proteico das mitocôndrias sinápticas com o das não sináp ticas, que se localizam primariamente no corpo celular dos neurónios, bem como noutros tipos de células neurais. Das várias diferenças encontradas, foi constatado que as enzimas envolvidas no catabolismo dos corpos cetónicos apresentavam uma expressão mais elevada nas mitocôndrias sinápticas em comparação com as não sinápticas. Tendo por base a análise proteómica acima referida, este trabalho teve como objetivo revelar o papel do β-HB na manutenção da homeostase energética das mitocôndrias sinápticas e dos neurônios. Como modelo experimental inicial, utilizámos frações isoladas de mitocôndrias sinápticas e não-sinápticas de murganhos wild type C57Bl/6J com 8 semanas. Começámos por avaliar os níveis e a função das enzimas do catabolismo dos corpos cetónicos, 3- hidroxibu7rato desidrogenase (BDH1) e Succinil CoA: 3-oxoácido CoA transferase (SCOT), bem como o efeito do β-HB na respiração destas populações específicas de mitocôndrias. De forma a analisar os níveis de expressão destas enzimas recorremos a técnica de Westernblot. Usando frações mitocondriais sinápticas e não-sinápticas de 4 isolamentos independentes, não foram detetadas diferenças substanciais nos níveis de expressão destas enzimas quando comparadas ambas as frações. Com o intuito de analisar a função destas enzimas nas duas frações de mitocôndrias (sinápticas e não-sinápticas), recorremos ao teste Mitoplate S-1 (adaptado para a utilização exclusiva de β-HB), que permite averiguar a atividade enzimática das enzimas do catabolismo dos corpos cetónicos e da transferência dos eletrões provenientes do mesmo à cadeia de transporte de eletrões. Usando frações mitocondriais sinápticas e não-sinápticas de 6 isolamentos diferentes, realizámos 6 testes Mitoplate S-1. Os resultados obtidos destes testes indicam que as mitocôndrias não sinápticas apresentam uma atividade enzimática significativamente maior (+53,3%) em comparação com as mitocôndrias sinápticas. Por último, analisámos o possível efeito do β-HB na capacidade respiratória das mitocôndrias isoladas de ambas as frações, através do Mitostress test usando o Seahorse Extracellular Flux 24 Analyzer. Este ensaio permite a monotorização em tempo real do consumo de oxigênio das mitocôndrias isoladas ou em células. Visto que a transferência de eletrões pela cadeia de transporte de eletrões termina na redução de oxigénio, o consumo de oxigénio pode ser usado como medida para analisar a respiração mitocondrial. Durante o ensaio, diferentes moduladores do processo de fosforilação oxidativa são introduzidos no tampão/meio das mitocôndrias/células e através da resposta em termos de consumo de oxigénio a estes moduladores é possível quantificar vários parâmetros de flexibilidade respiratória das mitocôndrias. Com base nos resultados obtidos deste ensaio, a presença de β-HB apresenta uma tendência em contribuir para um aumento específico da respiração basal das mitocôndrias sinápticas, sendo a magnitude da mesma, dependente da concentração de β-HB. No entanto, o β-HB parece não ter um impacto significativo na flexibilidade respiratória das mitocôndrias, tanto sinápticas como não-sinápticas. Para investigar o impacto dos corpos cetónicos, sob a forma de β-HB, num contexto celular mais completo, utilizámos neurónios primários isolados de embriões (E18) de murganhos wild type C57Bl/6J como modelo experimental. Como parâmetros de avaliação, estudou-se o efeito da suplementação de β-HB na manutenção da homeostase energética dos neurónios, através do seu efeito nos níveis de conteúdo de Adenosina trifosfato (ATP) neuronal, bem como na capacidade respiratória dos neurónios quando expostos a diferentes fontes de combustável em condições de baixa disponibilidade de glucose, simulando, assim, um cenário de privação de substratos. Isto permitu-nos averiguar se o papel do β-HB na bioenergética dos neurónios é independente ou condicionado por outros substratos. Para avaliar os níveis de ATP, recorremos à utilização de um ensaio de detenção de luminescência com base na reação do ATP com Luciferina, cuja reação é catalisada pela Luciferase. Este ensaio permite estimar a concentração de ATP presente nos neurónios com base na intensidade da luminescência produzida pelo produto desta reação. Começámos por incubar os neurónios em meio de cultura contendo diferentes concentrações de glucose (25mM, 5mM, 1mM e 0mM) e na presença ou ausência de 5mM de β-HB por um período de 48h. Com estas condições experimentais, observámos uma redução significativa nos níveis de ATP em condições de escassez de glucose (5mM, 1mM e 0mM) quando comparado com a condição controlo (25mM glucose). Em adição, as reduções dos níveis de ATP foram tanto maiores quanto menor a disponibilidade de glucose no meio. Em relação ao efeito de β-HB nos níveis de ATP, observámos que este contém alguma capacidade de restaurar estes níveis. Notavelmente, o impacto do β-HB demonstra uma tendência para ser mais acentuado consoante o decréscimo da concentração de glucose. De seguida, avaliámos este efeito em períodos de incubação mais pequenos, 1 hora e 24 horas, utilizando o meio de incubação contendo 5mM de glucose e na presença ou ausência de β-HB (0mM, 5mM ou 10mM). Os resultados destes ensaios demonstraram um efeito semelhante ao observado no período de 48h. Observámos um aumento dos níveis de ATP correlacionado com a concentração de β-HB. Notavelmente, a capacidade do β-HB em restaurar os níveis de ATP é aumentado em períodos mais curtos como o de 1 hora, em que 5mM e 10mM β-HB restauram respe7vamente 49% e 73% dos níveis de ATP detetados no controlo (NB). Para avaliar o efeito do β-HB na capacidade respiratória dos neurónios, recorremos ao Mitostress test, semelhante ao que foi descrito acima no contexto de mitocôndrias isoladas. Nos ensaios realizados com um período de incubação de 48 horas e 24 horas, a capacidade respiratória dos neurónios expostos a condições de privação de glucose foi comprometida, sendo que os neurónios não reagiram às injeções dos moduladores respiratórios. No entanto, nos ensaios com incubações mais curtas (1 hora), a capacidade respiratória permaneceu funcional e a presença de 5mM de β-HB levou a um aumento da mesma. Adicionalmente, confirmámos a capacidade dos neurónios em manter a capacidade respiratória na ausência de outros substratos (Piruvato e L-glutamina). Este aumento da capacidade respiratória foi principalmente evidente ao nível da respiração máxima, assemelhando-se a uma possível necessidade de aumentar a produção de ATP. Estes resultados são indicativos que a presença de β-HB em períodos de alta necessidade energética é benéfico para os neurónios, permitindo com que os mesmos mantenham flexibilidade para corresponder a estas necessidades. Em suma, este trabalho destaca as vantagens do β-HB como fonte de combustável neuronal em condições de disponibilidade limitada de substratos. Tendo vindo a ganhar especial destaque nos últimos anos, a possibilidade de haver uma fonte de produção de corpos cetónicos dentro do cérebro proveniente de outras células neurais, sugere que o β-HB possa ter um impacto no suporte energético dos neurónios ainda mais significativo, principalmente durante períodos de stress.
The brain is a very energy-demanding organ, primarily relying on glucose as its main source of fuel to sustain its functions. However, the brain can adapt its metabolism in conditions of low glucose levels and utilize other substrates to fuel ATP production such as Ketone bodies (KBs). KBs are small, water-soluble molecules derived from famy acid metabolism. They are primarily synthesized in the liver during periods of reduced glucose availability, such as fasting or a low-carbohydrate diet. The most prevalent KB, β-hydroxybutyrate (β-HB), can be metabolized by neurons in their mitochondria to generate acetyl-CoA that can be used to fuel the citric acid cycle (TCA cycle) and produce ATP through Oxidative phosphorylation (OXPHOS). Synaptic mitochondria, the mitochondria present at the synapses in neurons, possess distinct biochemical properties that suit their environmental needs. Specially, the synaptic region is known to be a very energetic environment, as a great amount of ATP is required to maintain neuronal membrane potentials and allow communication between neurons. In line with this, the host laboratory performed a proteomic screen to compare synaptic mitochondria with other non-synaptic mitochondria located mainly in the neuronal cell body and other neural cells. From several hits, enzymes involved in the catabolism of KBs were found to be upregulated in synaptic mitochondria when compared to non-synaptic ones. Further building on these findings, this work intended to unveil the role of β-HB in the energetic homeostasis of synaptic mitochondria and neurons. For this, we used isolated fractions of synaptic and non-synaptic mitochondria from wild-type C57Bl/6J mice. We evaluated the levels and the function of the Ketolysis enzymes, 3-Hydroxybutyrate Dehydrogenase 1 (BDH1) and succinyl CoA: 3-oxoacid CoA transferase (SCOT), and also the effect of β-HB on overall mitochondrial respiration of these two mitochondrial populations. Our results indicate that at steady state non-synaptic mitochondria exhibit significant higher enzymatic activity in catabolising β-HB and fuelling the electron transport chain (ETC) (+53,3%). In addition, β-HB does not seem to have a significant impact on the respiratory flexibility of mitochondria. Nevertheless, the presence of β-HB appears to lead to a specific and dose-dependent increase in the basal respiration of synaptic mitochondria. To investigate the impact of β-HB in maintaining energetic homeostasis of neurons we evaluated its ability to sustain ATP levels and respiratory capacity when neurons were exposed to different fuel sources and subjected to low glucose conditions, simulating a state of starvation. For this, we used primary neurons isolated from wild-type C57Bl/6J mice and assessed ATP content and performed mitochondrial respiratory rates. We observed a significant reduction in ATP levels when glucose was scarce, and β-HB showed the ability to partially restore these levels, with the extent of recovery depending on the duration of glucose deprivation. Notably, the impact of β-HB appeared to be more pronounced as glucose concentrations decreased. The respiratory rate assays provided insights into the respiratory capacity of neurons during starvation. For longer periods of 48h and 24h, the respiratory capacity was compromised. However, over shorter durations such as 1h, the respiratory capacity remained functional and even increased when exposed to 5mM of β-HB. This increase in capacity was particularly observed in their ability to enhance maximal respiration, resembling a response to increased ATP demand. This work highlights the energy-providing advantages of β-HB as a neuronal fuel source in conditions of limited fuel, specifically glucose, availability. Considering the potential of astrocytes as β-HB producers, it suggests that the role of β-HB in supporting stressed neurons could be more significant than initially anticipated.
The brain is a very energy-demanding organ, primarily relying on glucose as its main source of fuel to sustain its functions. However, the brain can adapt its metabolism in conditions of low glucose levels and utilize other substrates to fuel ATP production such as Ketone bodies (KBs). KBs are small, water-soluble molecules derived from famy acid metabolism. They are primarily synthesized in the liver during periods of reduced glucose availability, such as fasting or a low-carbohydrate diet. The most prevalent KB, β-hydroxybutyrate (β-HB), can be metabolized by neurons in their mitochondria to generate acetyl-CoA that can be used to fuel the citric acid cycle (TCA cycle) and produce ATP through Oxidative phosphorylation (OXPHOS). Synaptic mitochondria, the mitochondria present at the synapses in neurons, possess distinct biochemical properties that suit their environmental needs. Specially, the synaptic region is known to be a very energetic environment, as a great amount of ATP is required to maintain neuronal membrane potentials and allow communication between neurons. In line with this, the host laboratory performed a proteomic screen to compare synaptic mitochondria with other non-synaptic mitochondria located mainly in the neuronal cell body and other neural cells. From several hits, enzymes involved in the catabolism of KBs were found to be upregulated in synaptic mitochondria when compared to non-synaptic ones. Further building on these findings, this work intended to unveil the role of β-HB in the energetic homeostasis of synaptic mitochondria and neurons. For this, we used isolated fractions of synaptic and non-synaptic mitochondria from wild-type C57Bl/6J mice. We evaluated the levels and the function of the Ketolysis enzymes, 3-Hydroxybutyrate Dehydrogenase 1 (BDH1) and succinyl CoA: 3-oxoacid CoA transferase (SCOT), and also the effect of β-HB on overall mitochondrial respiration of these two mitochondrial populations. Our results indicate that at steady state non-synaptic mitochondria exhibit significant higher enzymatic activity in catabolising β-HB and fuelling the electron transport chain (ETC) (+53,3%). In addition, β-HB does not seem to have a significant impact on the respiratory flexibility of mitochondria. Nevertheless, the presence of β-HB appears to lead to a specific and dose-dependent increase in the basal respiration of synaptic mitochondria. To investigate the impact of β-HB in maintaining energetic homeostasis of neurons we evaluated its ability to sustain ATP levels and respiratory capacity when neurons were exposed to different fuel sources and subjected to low glucose conditions, simulating a state of starvation. For this, we used primary neurons isolated from wild-type C57Bl/6J mice and assessed ATP content and performed mitochondrial respiratory rates. We observed a significant reduction in ATP levels when glucose was scarce, and β-HB showed the ability to partially restore these levels, with the extent of recovery depending on the duration of glucose deprivation. Notably, the impact of β-HB appeared to be more pronounced as glucose concentrations decreased. The respiratory rate assays provided insights into the respiratory capacity of neurons during starvation. For longer periods of 48h and 24h, the respiratory capacity was compromised. However, over shorter durations such as 1h, the respiratory capacity remained functional and even increased when exposed to 5mM of β-HB. This increase in capacity was particularly observed in their ability to enhance maximal respiration, resembling a response to increased ATP demand. This work highlights the energy-providing advantages of β-HB as a neuronal fuel source in conditions of limited fuel, specifically glucose, availability. Considering the potential of astrocytes as β-HB producers, it suggests that the role of β-HB in supporting stressed neurons could be more significant than initially anticipated.
Descrição
Tese de mestrado, Investigação Biomédica, Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2024
Palavras-chave
β-Hidroxibutirato Mitocôndrias sinápticas Neurónios Bioenergética Sinapses Metabolismo Teses de mestrado - 2024