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Publicação
Prevention of breast cancer brain metastases by minocycline-loaded liposomes
| Nome: | Descrição: | Tamanho: | Formato: | |
|---|---|---|---|---|
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Orientador(es)
Resumo(s)
O cancro da mama (CM) é um tumor maligno que geralmente se inicia nas células epiteliais
dos ductos mamários. É atualmente a patologia maligna mais comum nas mulheres, podendo
atingir 3,2 milhões de novos casos por ano até 2050. De todos os subtipos de CM, o triplo negativo é um dos mais agressivos e propenso a desenvolver metástases encefálicas, sendo a
principal causa de morte em pacientes diagnosticados com CM. Depois de estabelecidas as
metástases encefálicas de CM (MECM), as opções terapêuticas são reduzidas, levando a um
prognóstico devastador com apenas 20% de taxa de sobrevida ao fim de um ano. O
desenvolvimento metastático é um processo altamente complexo, no qual as células do cancro
da mama (CCMs) adquirem propriedades invasivas, destacando-se primeiramente do tumor
primário e entrando em circulação, através da qual se irão espalhar por todo o organismo.
Quando em circulação, deparam-se com a barreira hematoencefálica (BHE), uma barreira
altamente seletiva, caracterizada pela expressão de complexos intercelulares que lhe conferem
uma elevada impermeabilidade, de modo a limitar a entrada da maioria dos agentes citotóxicos
no encéfalo. No entanto, apesar da baixa permeabilidade da BHE, as CCMs conseguem aderir
às células endoteliais da microvasculatura encefálica (CEME) e comprometer as junções
intercelulares e, consequentemente, a integridade da BHE, culminando na colonização do
encéfalo. Deste modo, é imperativo descobrir novas estratégias preventivas que impeçam a
formação de MECM. Neste sentido, estudos in vitro anteriores de screening de uma biblioteca
de compostos, revelaram o cloridrato de minociclina (MH), um antibiótico utilizado há décadas
na prática clínica, como o melhor candidato para modular as propriedades da BHE e das CCMs,
prevenindo a sua transmigração para o encéfalo. Para avaliar em profundidade as propriedades
da MH ao nível da BHE e na prevenção da transmigração endotelial de CCMs, foi desenvolvida
uma nova nano formulação para uma entrega especifica e direcionada ao endotélio da
microvasculatura encefálica, baseada num sistema de encapsulação da MH em lipossomas
funcionalizados com Ri7-217 (Ri7), um anticorpo que reconhece o recetor da transferrina
(TfRAb), altamente expresso nas CEME. Esta nano formulação (Ri7-MH-Lip) mostrou ser
eficaz na melhoria das propriedades de BHE quando em contato com células metastáticas, bem
como na prevenção da adesão de CCMs ao endotélio da BHE, validando a MH como molécula
promissora no que diz respeito à prevenção da formação de MECM in vivo. Tendo como
hipótese que a MH é capaz de impedir a transmigração de CCMs modulando as propriedades
da barreira, este projeto teve como objetivo avaliar a segurança do tratamento com Ri7-MH-lip
x
num modelo de MECM em murganho, validar a sua eficácia na prevenção da formação de ME
e determinar a sua capacidade para melhorar as propriedades da BHE in vivo. Sabendo que um
modelo animal robusto e reprodutível com formação preferencial de ME é crucial para
desenvolver novas terapias de prevenção de MECM, procedemos à implementação deste
modelo em Portugal. Este novo modelo teve por base a inoculação de células 4T1 (células de
CM triplo-negativo) na artéria carótida comum de murganhos Balb/c fêmea com 8-10 semanas
de idade, com o objetivo de direcionar as células malignas para o encéfalo e permitir a formação
preferencial de metástases encefálicas. Após a implementação do modelo, este foi caracterizado
em termos do desenvolvimento de metástases encefálicas por coloração hematoxilina-eosina
(HE) dos encéfalos e órgãos periféricos (pulmão, rim e fígado) a diferentes tempos (7, 10 e 14
dias) após a inoculação de células 4T1. A análise de secções do hipocampo cranial e cerebelo
revelou a expansão gradual de MECM no hipocampo cranial, enquanto a sua presença foi
insignificante no cerebelo. Em relação aos órgãos periféricos, apenas foram detetadas
metástases nos pulmões. Com o objetivo de entender se o aumento da área tumoral ao longo do
tempo resultava de uma capacidade proliferativa progressiva das CCMs, a expressão do
marcador de proliferação, Ki-67, foi avaliada juntamente com o marcador epitelial, Pan citoqueratina, aos 10 e 14 dias após inoculação de células 4T1, a fim de visualizar lesões
metastáticas em cortes craniais do hipocampo. Foi observado um aumento significativo na
expressão dos dois marcadores dos 10 para os 14 dias, refletindo um aumento da proliferação
das células tumorais durante a progressão das metástases encefálicas e uma reaquisição de
características epiteliais durante a colonização e estabelecimento das metástases. Estes
resultados foram reforçados pelo padrão de expressão do marcador epitelial lectina de tomate
(T-lectina) nas metástases, enfatizando a manifestação de características epiteliais pelas células
tumorais ao longo do tempo. Em seguida, com o objetivo de avaliar a toxicidade da formulação
desenvolvida, os órgãos periféricos (coração, pulmões, fígado e rins) de murganhos não
inoculados com células tumorais foram recolhidos para análise histológica e o seu plasma foi
colhido para análise de marcadores de toxicidade cardíaca, hepática e renal. Não foram
observadas diferenças entre o grupo controlo e grupo tratado com a formulação, tanto na análise
histológica, como na análise do plasma, sugerindo que esta não apresenta toxicidade periférica.
Depois de aferir a segurança do tratamento, procedemos à avaliação da eficácia da formulação
Ri7-MH-Lip com 3.5 mg/Kg de MH na prevenção da transmigração de CCMs em murganhos
Balb/c fêmea de 8 a 10 semanas de idade sacrificados 10 dias após a inoculação de células 4T1
na artéria carótida comum. Através da coloração HE, foi possível observar um decréscimo
significativo no número de metástases nas secções de hipocampo cranial e na região do
xi
hipocampo em murganhos injetados com a nano formulação em comparação com o grupo
controlo, embora não tenham sido observadas diferenças significativas relativamente à área de
metástases entre os dois grupos. Mais ainda, analisando apenas a área do hipocampo, foi
possível observar uma redução significativa no número e área de metástases nos murganhos
tratados com Ri7-MH-Lip, quando comparados com o grupo controlo. Ainda com o objetivo
de caracterizar o comportamento da BHE após o tratamento com Ri7-MH-Lip, a expressão de
zonula occludens (ZO)-1, uma das mais importantes proteínas das junções de oclusão, foi
avaliada por imunohistoquímica. Esta análise e quantificação revelou um aumento da expressão
de ZO-1 nos vasos, sugerindo uma melhoria das propriedades da BHE após o tratamento. Por
fim, este trabalho teve, ainda, como objetivo avaliar se o tratamento com Ri7-MH-Lip é capaz,
não só de prevenir a transmigração de CCMs para o encéfalo, como também de prolongar o
tempo de vida de murganhos portadores de MECM. Para este efeito, murganhos Balb/c foram
inoculados com células 4T1 na artéria carótida comum, sendo que o grupo não tratado recebeu
apenas veículo (NaCl 0,9%) e o grupo tratado recebeu o equivalente a 3.5 mg/Kg de MH por
injeção. Foi monitorizada a sobrevivência ao longo do tempo e foi possível observar que os
animais tratados com a formulação apresentaram um prolongamento do tempo de vida em
relação ao grupo não tratado. Para validar estes resultados, procedemos ainda à análise
histológica, através da coloração HE, onde foram observadas metástases totalmente
desenvolvidas em cortes do hipocampo cranial no grupo não tratado, em comparação com o
grupo tratado com a formulação. Em síntese, durante a realização deste trabalho foi possível
implementar e caracterizar um novo modelo animal de MECM. Foi também possível
demonstrar a eficácia da MH em prevenir a transmigração CCMs para o encéfalo, consequente
formação de ME e preservar a integridade da BHE in vivo, bem como a segurança da estratégia
terapêutica. Este estudo contribui, assim, para o avanço científico no desenvolvimento de novas
terapias preventivas na neuroncologia, nomeadamente para MECM.
As the leading global cancer occurrence, breast cancer (BC) raises a major concern, especially in the disease’s metastatic stage, with the brain being one of the top metastasization sites, which leaves patients with an unfortunate prognosis. During the metastatic process, BC cells (BCCs) encounter the blood-brain barrier (BBB), shielding the brain from most cytotoxic agents. Despite BBB’s restricted permeability, BCCs can still reach the brain and lead to breast cancer brain metastases (BCBM) formation. Previous studies aiming to disclose a pharmacological BBB modulator able to prevent BCCs extravasation exposed minocycline hydrochloride (MH), a clinically used antibiotic, as a promising agent in preventing BBB disruption and BCCs. In vitro studies developed a new formulation using Ri7-217 (Ri7), an anti-transferrin receptor antibody, as a targeting vector for MH-loaded liposomes (Ri7-MH-Lip) to act upon the BBB. Hypothesizing that MH specifically delivered to the BBB could prevent BCCs’ transmigration and BCBM formation, this project aimed to ascertain Ri7-MH-Lip treatment's safety in a BCBM’s mouse model and establish its efficacy in preventing BCBM formation in vivo. To this end, we implemented and characterized a BCBM mouse model where the formulation’s peripheral toxicity was evaluated through biochemical and histological analysis and shown to be insignificant. The assessment of the treatment’s efficacy in preventing BCBM was based on cranial hippocampus sections’ histological analysis and zonula occludens immunofluorescence evaluation 10 days after BCC’s injection, where a BCBM’s reduction and increment in barrier’s integrity was observed. In addition, we aimed to ascertain if the treatment could, not only prevent BCCs transmigration, but also efficiently extend the life span of BCBM-bearing animals and a higher survival was observed in treated mice. Altogether, these results demonstrate the potential of Ri7-MH-Lip formulation in BBB’s preservation and BCBM prevention.
As the leading global cancer occurrence, breast cancer (BC) raises a major concern, especially in the disease’s metastatic stage, with the brain being one of the top metastasization sites, which leaves patients with an unfortunate prognosis. During the metastatic process, BC cells (BCCs) encounter the blood-brain barrier (BBB), shielding the brain from most cytotoxic agents. Despite BBB’s restricted permeability, BCCs can still reach the brain and lead to breast cancer brain metastases (BCBM) formation. Previous studies aiming to disclose a pharmacological BBB modulator able to prevent BCCs extravasation exposed minocycline hydrochloride (MH), a clinically used antibiotic, as a promising agent in preventing BBB disruption and BCCs. In vitro studies developed a new formulation using Ri7-217 (Ri7), an anti-transferrin receptor antibody, as a targeting vector for MH-loaded liposomes (Ri7-MH-Lip) to act upon the BBB. Hypothesizing that MH specifically delivered to the BBB could prevent BCCs’ transmigration and BCBM formation, this project aimed to ascertain Ri7-MH-Lip treatment's safety in a BCBM’s mouse model and establish its efficacy in preventing BCBM formation in vivo. To this end, we implemented and characterized a BCBM mouse model where the formulation’s peripheral toxicity was evaluated through biochemical and histological analysis and shown to be insignificant. The assessment of the treatment’s efficacy in preventing BCBM was based on cranial hippocampus sections’ histological analysis and zonula occludens immunofluorescence evaluation 10 days after BCC’s injection, where a BCBM’s reduction and increment in barrier’s integrity was observed. In addition, we aimed to ascertain if the treatment could, not only prevent BCCs transmigration, but also efficiently extend the life span of BCBM-bearing animals and a higher survival was observed in treated mice. Altogether, these results demonstrate the potential of Ri7-MH-Lip formulation in BBB’s preservation and BCBM prevention.
Descrição
Tese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, 2022, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia
Palavras-chave
Blood-brain barrier Breast cancer brain metastases Minocycline hydrochloride Liposome In vivo animal model Teses de mestrado - 2022