Research Institute for Medicines

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Mining the characteristics of the binding pocket in druggable and undruggable proteins to foster innovative drug design

Publication . Gomes, Bruno Filipe Andrade; Guedes, Rita Alexandra do Nascimento Cardoso; Aniceto, Natália

Os alvos terapêuticos utilizados atualmente para o tratamento de doenças constituem uma percentagem muito reduzida do proteoma humano. Os mesmos alvos são recorrentemente utilizados no processo de desenvolvimento de fármacos, nomeadamente na identificação de pequenas moléculas que possam modelar a sua atividade. Uma vez que apenas uma percentagem muito resumida do proteoma é utilizado no desenvolvimento de fármacos, uma das principais estratégias para a inovação na descoberta é a validação de “novos” alvos terapêuticos. Aqui, propomos uma nova estratégia para a validação de alvos terapêuticos que sabemos estarem envolvidos em doenças, mas para os quais se tenha mostrado difícil o desenvolvimento de moléculas com efeito farmacológico ou para os quais não exista informação da existência de moléculas que modelem a sua atividade. Este objetivo será alcançado com recurso a um conjunto de métodos computacionais baseados na similaridade estrutural de cavidades entre, os dois tipos de alvos previamente mencionados e proteínas bem estudadas para as quais foram já desenvolvidos potenciais modeladores, alguns já aprovados ou em ensaios clínicos. Assim, foram identificados e agrupados todos os alvos difíceis de modelar, resultando num total de 15 potenciais alvos terapêuticos agrupados como DOPE, e todos os alvos bem estudados foram agrupados como Well-Knowns. As cavidades de cada uma das proteínas foram determinadas utilizando o programa CAVIAR, seguido da uma procura de similaridade estrutural (PocketMatch). O centro ativo da proteína Large neutral Amino acid Transporter small subunit 1 (LAT1) apresentou similaridade com a butirilcolinesterase (BChE) e foi considerado o alvo mais promissor para o desenvolvimento da estratégia delineada. O último processo consistiu no screening virtual de um conjunto de moléculas com efeito biológico (inibidores já conhecidos) na butirilcolinesterase obtidas a partir da base de dados ChEMBL e na identificação e seleção dos compostos para os quais foi prevista uma afinidade significativa para com a proteína LAT1. De uma biblioteca de 837 compostos únicos, seis mostraram boa afinidade para com a LAT1, dos quais três foram capazes de mimetizar interacções (proteína-ligando) que os inibidores da LAT1 possuem nas estruturas cristalográficas do PDB. Demonstrou-se assim que métodos computacionais baseados na pesquisa por similaridade estrutural das cavidades das proteínas é uma estratégia promissora para a identificação de “novos” alvos terapêuticos.

2022-12-22Master thesis

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Using iPSCs-derived microglia from Alzheimer´s disease patients to assess early cell deficits and neurotoxic properties

Publication . Lopes, Daniela Sofia Barbosa; Brites, Dora 1951-; Carvalho, Margarida Henriques da Gama 1972-

A doença de Alzheimer (DA) é a doença neurodegenerativa progressiva e irreversível mais comum, sendo caracterizada pela perda de memória, deficiência cognitiva e anomalias comportamentais. Como a maioria das doenças, esta patologia resulta de uma mistura de fatores genéticos e ambientais. A marca principal da DA é a secreção das formas amiloide-β (Aβ), e das placas senis associadas compostas por agregados de Aβ e outras proteínas misfolded. Tais anomalias podem ter uma base genética, como a existência de uma mutação quer na Proteína Precursora Amiloide (APP) quer na sua maquinaria proteolítica. Outra anormalidade é o ganho ou perda de função da presenilina 1 (PSEN1) ou 2 (PSEN2) que causa a DA familiar precoce. Por outro lado, a DA esporádica, apesar de não ter uma regra padrão pode estar relacionada, por exemplo, com uma mutação em Apolipoproteína E (APOE). Durante muitos anos, a hipótese da cascata amiloide foi a melhor teoria para explicar a fisiopatologia da DA. Por isso, é normal que as vias metabólicas envolvidas na formação de placas amiloides sejam objeto de múltiplos estudos. A DA não tem cura, a pesquisa continua, mas a doença ainda apresenta vários obstáculos à sua compreensão completa. Microglia, as células imunitárias inatas do sistema nervoso central são responsáveis por muitas funções para sustentar a homeostase cerebral, incluindo as envolvidas na resposta reparadora, a qual parece falhar na DA, nomeadamente em estádios avançados da doença. A microglia num estado estacionário exibe um fenótipo particular, caracterizado por ter um corpo celular de pequenas dimensões e ramificações que se estendem em todas as direções. Esta morfologia ramificada permite que a microglia monitorize o ambiente sem interferir com as atividades neuronais. Dependendo dos estímulos e do tempo de exposição, a microglia adquire várias modificações nos seus fenótipos. Estes fenótipos podem variar de inflamatórios e citotóxicos a mais pró-regenerativos, sendo na maioria dos casos uma mistura de fenótipos que são difíceis de descrever. Isto indica que a microglia ativada, disfuncional ou degenerativa pode contribuir de forma diferente para o início e progressão de tal desordem. Assim, torna-se crucial compreender a interação entre neurónios e células microgliais na doença de DA desde o seu início. No entanto, o cérebro humano é uma estrutura altamente complexa que não pode ser facilmente explorada in vivo e tem-se revelado difícil de modelar in vitro. Muitos dos modelos (linhas de células humanas e animais, invertebrados, peixe-zebra e modelos de animais roedores) representam momentos chave na compreensão do cérebro humano e nas interações celulares entre vários tipos de células. O isolamento da microglia a partir de tecidos post-mortem ou amostras cirúrgicas pode introduzir artefactos técnicos. Como resultado, modelos celulares recentes gerados a partir de células somáticas do paciente, utilizando a tecnologia de reprogramação de células estaminais pluripotentes induzidas (iPSC) forneceram ferramentas promissoras para compreender os mecanismos da doença humana, incluindo a DA. Neste trabalho, pretendíamos desenvolver um modelo humano capaz de recapitular o potencial patológico da microglia, ultrapassando assim as diferenças específicas das espécies e permitindo a aplicação na clínica. Para isso, usámos a microglia derivada de iPSCs de indivíduos saudáveis (controlo) e de doentes AD com mutações na presenilina 1 (PSEN1) e na Swedish (Swe), primeiro pela sua diferenciação a partir de iPSCs em EMPs e depois em microglia primitiva, geradas na University of Eastern Finland pela Profª Tarja Malm. Como as células eritromielóides (EMPs) podem ser congeladas, foram essas que nos foram enviadas e maturadas no nosso laboratório durante 2 dias até atingir o estádio de maturação própria para os estudos que realizámos - microglia induzida (iMicroglia). O método na sua globalidade é conseguido de forma relativamente rápida (apenas 24 dias), requerendo poucos reagentes quando comparados com outros e sendo relativamente fácil. Foi também usado um controlo isogénico, derivado do mesmo doente com mutação PSEN1, mas onde se fez a correção da mesma. A capacidade de trabalhar com iMicroglia diferenciada de iPSCs dos pacientes com DA abre espaço para uma melhor compreensão da doença e para o desenvolvimento de novas estratégias clínicas. As dificuldades surgem da heterogeneidade muitas vezes elevada da população de células que se obtém, da diferente maturação funcional e da especificidade regional. Após maturação as células foram caracterizadas por marcadores específicos e associados à microglia. De seguida, investigámos alterações na expressão de marcadores reativos e miRNAs associados a inflamatórios (miRNAs) em todas as linhas celulares diferenciadas e num controlo isogénico em que o gene PSEN1 foi corrigido (ISO PSEN1). Neste trabalho demonstrámos que a iMicroglia pode ser gerada de forma eficiente a partir de iPSCs seguindo um protocolo definido. É importante notar que a iMicroglia mostrou os habituais marcadores de microglia com base na expressão genética e dados proteicos da imunofluorescência, ao mesmo tempo que revelou a capacidade fagocítica. Testámos a capacidade fagocítica da iMicroglia gerada, uma vez que um dos problemas apontados à microglia no caso da AD é a sua ineficiência na eliminação das placas Aβ. Como esperado, a iMicroglia espontaneamente fagocitou as beads fluorescentes. Também identificámos alterações na morfologia celular das diferentes linhas celulares, os resultados não demonstraram diferenças entre o Controlo e as mutações PSEN1 e Swe em relação ao seu perímetro ou ao diâmetro de Feret. No que diz respeito à área, enquanto as células Swe mostraram um aumento na área celular, as ISO PSEN1 mostraram uma ligeira redução vs. Controlo. Analisámos ainda a expressão de marcadores celulares na iMicroglia que estão atualmente ligados à neuroinflamação e relacionados com o comportamento celular em AD, e.g., iNOS, CX3CR1, TREM2, MFGE8 e Arg1, na microglia PSEN1. Algumas destas alterações desapareceram na linha ISO PSEN1. Os resultados demonstram uma deficiência geral da maquinaria fagocítica e inflamatória, especialmente em iMicroglia PSEN1. Certos marcadores celulares eram mais notórios após a ativação das células com o interferão (IFN)-γ e com o lipopolissacarídeo (LPS). No que diz respeito aos miRNAs, observámos uma sobre-expressão de miRNA (miR)-146a e miR-21 em células com mutações Swe e PSEN1, relativamente ao controlo, enquanto nas isogénicas todos os miRNAs foram encontrados elevado e a área celular reduzida por provável manipulação genética. A iMicroglia PSEN1 revelou Arg1baixo, TREM2baixo e MFGE8alto, e após estimulação com IFN-γ + LPS, manteve Arg1baixa e MFGE8alta, mas iNOSalto. A estimulação causou miR-125balto nas células Swe e PSEN1, mas não nas ISO PSEN1. Assim, as mutações Swe e PSEN1 desregulam os marcadores de polarização microglial tanto antes, como após estimulação com IFN- γ + LPS. As células ISO PSEN1 mostraram aumento de Arg1 e MFGE8, e diminuição de iNOS e de miR-146a, após estimulação relativamente às não estimuladas, mantendo a sua capacidade funcional. O nosso estudo foi inovador na identificação de alterações na assinatura inflamatória microglial em subpopulações de doentes com AD familiar, as quais podem ajudar na estratificação dos doentes. Serviu também para evidenciar que a correção isogénica apenas restaura parte do fenótipo saudável, enquanto exacerba a expressão dos miRNAs inflamatórios. Outra descoberta importante e pioneira foi a de que os miRNAs nas células Swe e PSEN1 não respondem a estímulo adicional e nas ISO PSEN1 até os regulam negativamente. Obtivemos muitos resultados heterogéneos em termos de marcadores e miRNAs, que também observados noutros estudos, reforçando que os pacientes com DA têm assinaturas inflamatórias específicas, e por isso, beneficiariam muito de uma medicina individualizada. Em conclusão, os resultados obtidos para a microglia derivada dos iPSCs, apesar de promissores deverão ser complementados com mais estudos de modo a fomentar os esforços no combate à DA. A possibilidade de revitalização da microglia disfuncional pode ser mais importante que os sucessivos compostos anti-inflamatórios propostos que sistematicamente falharam ou pioram a progressão da DA do paciente.

2021Master thesis

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Overview of Cosmetic Regulatory Frameworks around the World

Publication . Ferreira, Mariana; Matos, Ana; Couras, Ana; Marto, Joana; Ribeiro, Helena

To ensure safety and efficacy, cosmetic products are regulated and controlled worldwide. However, the regulatory approaches of each country may be significantly different and impact the competitiveness and economic viability of the industry. This work presents an updated review and comparison of regulatory requirements from the European Union, United States of America, Canada, Japan, People’s Republic of China and Brazil. It outlines contents such as the definition, classification and categorization of cosmetics, pre-market requirements, ingredients management, general labelling requirements, regulation of claims concerning advertisement and commercial practices, increase of animal testing and marketing bans on cosmetic products. Furthermore, it weighs the impact of regulatory differences on the safety and accessibility of these products in the mentioned regions.

2022-06Journal article

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Smart hybrid compounds to target the respiratory electron transport chain of mycobacterium tuberculosis

Publication . Nunes, Diogo Miguel de Oliveira; Lopes, Francisca da Conceição; Rocha, Maria de Jesus de Almeida Rainha Perry da Câmara Saldanha

A tuberculose, apesar de ser uma doença evitável e curável, mantém-se como uma epidemia global. Estima-se que em 2021, a tuberculose tenha sido a décima terceira maior causa de morte global e a segunda maior causa de morte induzida por um agente infecioso e que determinou, aproximadamente, 1,6 milhões de mortes. No mesmo ano, 10,6 milhões de pessoas terão contraído a doença e estimativas recentes indicam que um quarto da população mundial está infetado com o Mycobacterium tuberculosis (Mtb), o seu agente etiológico. O Mtb é um agente patogénico humano obrigatório, com várias características distintivas que o tornam um agente infecioso de excelência. Esta bactéria aproveita a resposta imunitária do hospedeiro para aumentar o grau de transmissão. Para além disso, possuí um arsenal metabólico extenso capaz de metabolizar os xenobióticos e uma parede celular única, com um elevado número de bombas de efluxo, que lhe confere uma alta impermeabilidade, permitindo-lhe adaptar-se às múltiplas pressões ambientais criadas pelo hospedeiro, adquirindo assim uma elevada resistência natural a fármacos. Por fim, esta micobactéria possui uma capacidade única de permanecer no hospedeiro num estado latente, caracterizado por uma fisiologia e metabolismo distinto, crescimento reduzido, tolerância a fármacos aumentada, e uma capacidade de não se deixar detetar pelo sistema imunitário. Um regime terapêutico anti-tubercular tem como objetivo diminuir a severidade da doença, evitar reincidências e o desenvolvimento de resistência, e para tal, necessita eliminar todas as populações de bacilos do hospedeiro. Devido às características próprias das bactérias latentes, os regimes terapêuticos anti-tuberculares têm durações bastante prolongadas e características de polimedicação, apresentando por isso efeitos adversos cumulativos. Consequentemente, os regimes terapêuticos anti-tuberculares têm baixa adesão e tolerância por parte dos doentes, podendo resultar na emergência de tuberculose resistente a fármacos, que está associada a uma maior letalidade, e a um sucesso terapêutico inferior. Desta forma, o desenvolvimento de um regime terapêutico curto, potente, e eficiente em todas as formas de infeção é uma prioridade no controlo da tuberculose. Para tal, é essencial desenvolver novos fármacos que sejam eficientes, seguros, e bem-tolerados, e que preferencialmente atuem por novos mecanismos de ação, de forma a evitar a emergência de resistência. Esta premência não foi considerada nos últimos anos, sendo que apenas três fármacos anti-tuberculares (bedaquilina, delamanida e pretomanida) foram aprovados nos últimos quarenta anos, todos com efeitos secundários que comprometem a sua utilização prolongada. Assim, é crucial investir na descoberta e desenvolvimento de novos fármacos ativos contra a tuberculose latente e resistente, preferencialmente com novos mecanismos de ação e alvos diferentes. A cadeia de transporte de eletrões do Mtb surgiu recentemente como um alvo promissor para novos fármacos anti-tuberculares. Atualmente, cerca de 30% dos novos fármacos em ensaios clínicos têm como alvo um elemento da cadeia de transporte de eletrões, e cerca de 65% dos regimes farmacológicos em ensaios clínicos de fase III incluem um fármaco que inibe a cadeia de transporte de eletrões. Como ambas as formas bacterianas, latentes e replicantes, requerem um fornecimento contínuo de ATP, o metabolismo energético é um alvo apelativo, já que a sua inibição e consequente disrupção do fornecimento de ATP permite eliminar eficientemente as populações replicantes e latentes, e consequentemente, diminuir a duração dos regimes terapêuticos e a emergência de resistência. Este projeto inclui a síntese e caracterização de uma pequena biblioteca de ferramentas farmacológicas híbridas, capazes de inibir o citocromo bc1-aa3, a oxidase principal do Mtb, e, em simultâneo, o citocromo bd, uma oxidase alternativa que o bacilo utiliza em situações de hipoxia. Deste modo, pretende-se que estes compostos consigam inibir eficientemente a produção de ATP, e eliminar ambas as populações bacterianas replicantes e latentes. Os compostos híbridos têm uma estrutura comum, com um esqueleto de pirroloquinolona, provavelmente capaz de inibir o citocromo bc1-aa3 uma vez que é inibidor do citocromo bc1 do Plasmodium falciparum, uma proteína com alta homologia com o citocromo bc1-aa3 do Mtb; e um esqueleto de nitrofurano, que podendo ser reduzido in vivo pelas nitroreductases do Mtb, liberta óxido nítrico capaz de inibir o citocromo bd. As duas estruturas serão ligadas por um braço de ligação, que será a porção variável da biblioteca de compostos. Os compostos foram sintetizados por uma estratégia de síntese divergente, iniciada com a síntese do esqueleto da pirroloquinolona, com rendimentos elevados. De seguida, vários braços de ligação foram acoplados, com rendimentos moderados. Quando necessário, foi efetuada uma redução das funções químicas do braço de ligação (grupos nitro e nitrilo), por forma a garantir a presença de um grupo amina livre. Por fim, o esqueleto de nitrofurano foi acoplado, com rendimentos baixos, através de dois tipos de ligação: ligações amida (7a – 7d) e ligações imina (8a – 8c). Todos os compostos foram obtidos puros, exceto o composto 7d, cujas tentativas de purificação não foram bem sucedidas. Na síntese do composto 7c, isolou-se um produto de degradação – uma nitrofuranilamida (composto 7c’) – que foi caracterizado. Como o composto 7c foi somente obtido puro posteriormente, por restrições temporais não foram efetuados os ensaios subsequentes para este composto. A solubilidade aquosa dos compostos foi determinada por HPLC para os compostos 7c’ e 8c. Este ensaio não foi efetuado com os restantes compostos ((7a), (7b), (8a) e (8b)) por se ter verificado que tinham sofrido degradação extensiva. Ambos os compostos 7c’ e 8c demonstraram ter boa solubilidade aquosa, que juntamente com as propriedades físico-químicas previstas indicam que estes compostos, provavelmente, terão uma boa biodisponibilidade oral. Também se avaliou a estabilidade química (em tampão PBS), em plasma, e metabólica (em microssomas de ratinho), por HPLC para os compostos 7c’ e 8c. Ambos demonstraram ter um bom perfil farmacocinético, sendo que o composto 7c’ demonstrou ser mais estável que o composto 8c nos três meios testados. Comparando a estabilidade do composto 7c’ com outros compostos híbridos, nenhuma correlação foi identificada entre a ausência do esqueleto da pirroloquinolona e uma melhoria no perfil farmacocinético. A atividade anti-micobacteriana dos compostos 7c’, 8c, e de alguns intermediários foi testada contra duas estirpes de M. tuberculosis (uma estirpe nativa, H37Rv, e uma estirpe mutante, cydKO). Os resultados estão de acordo com o mecanismo de ação proposto em que os compostos híbridos têm como alvos ambos os citocromos, bc1-aa3 e bd, e a necessidade do grupo nitro ser substituinte num ciclo heteroaromático. O composto 8c apresentou atividade anti-micobacteriana com valores de MIC na gama micromolar, demonstrando que estes compostos híbridos são agentes anti-tuberculares promissores. O composto 7c’ foi o composto mais ativo, apresentando atividade anti-micobacteriana com valores de MIC na gama sub-micromolar, podendo indicar um mecanismo de ação distinto, uma vez que esta molécula não contém a subunidade pirroloquinolona. A toxicidade dos compostos 7c’ e 8c, tal como do percursor 6c, foi testada contra a linha celular HEK293. Os compostos 7c’ e 6c não apresentaram citotoxicidade, enquanto o composto 8c apresentou citotoxicidade superior, apesar de demonstrar alguma seletividade para as células bacterianas. Deste modo, os próximos passos deste projeto incluem a realização de ensaios de atividade dos compostos 7c’ e 8c em outras bactérias, de forma a avaliar a seletividade destes compostos; a avaliação biológica e farmacocinética dos restantes compostos híbridos; e o aumento da biblioteca de compostos híbridos.

2022-12-22Master thesis

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Unveiling a family of spiro-ß-lactams with anti-HIV and antiplasmodial activity via phosphine-catalyzed [3+2] annulation of 6-alkylidene-penicillanates and allenoates

Publication . Alves, Américo; Alves, Nuno G.; Bártolo, Inês; Fontinha, Diana; Caetano, Soraia; Prudêncio, Miguel; Taveira, Nuno; Melo, Teresa M. V. D. Pinho E

The molecular architecture of spirocyclic compounds has been widely explored within the medicinal chemistry field to obtain new compounds with singular three-dimensional pharmacophoric features and improved bioactivity. Herein, the synthesis of 68 new spirocyclopentene-β-lactams is described, resulting from a rational drug design and structural modulation of a highly promising lead compound BSS-730A, previously identified as having dual antimicrobial activity associated with a novel mechanism of action. Among this diverse library of new compounds, 22 were identified as active against HIV-1, with eight displaying an IC50 lower than 50 nM. These eight compounds also showed nanomolar activity against HIV-2, and six of them displayed micromolar antiplasmodial activity against both the hepatic and the blood stages of infection by malaria parasites, in agreement with the lead molecule’s bioactivity profile. The spirocyclopentene-β-lactams screened also showed low cytotoxicity against TZM-bl and Huh7 human cell lines. Overall, a family of new spirocyclopentene penicillanates with potent activity against HIV and/or Plasmodium was identified. The present structure–activity relationship open avenues for further development of spirocyclopentene-β-lactams as multivalent, highly active broad spectrum antimicrobial agents.

2022-10-07Journal article

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