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Publicação
Identification of a novel set of proteins as NMD intervenients
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Autores
Resumo(s)
O nonsense-mediated mRNA decay (NMD) é um mecanismo regulatório da expressão génica pós-transcricional. Atua principalmente prevenindo a terminação da tradução, quando um codão de terminação prematuro (PTC) está presente, impedindo, desta forma, a expressão de proteínas com efeitos potencialmente deletérios. Um PTC pode ser originado por mutações nonsense, ao nível do DNA, bem como por erros de outros processos do metabolismo do RNA mensageiro (mRNA). Para além disso, o mecanismo do NMD também está envolvido na regulação de outros processos biológicos. Tudo isto, bem como o conhecimento de que um PTC pode conduzir ao aparecimento de doenças genéticas hereditárias (cerca de 30%), torna o estudo do mecanismo do NMD extremamente relevante no contexto de doença. O seu entendimento, em termos de intervenientes, processos e ordem de acontecimentos, é, então, crucial para o desenvolvimento de novas terapias. Atualmente, estão descritas duas vias de ativação do NMD em transcritos contendo PTCs. Por um lado, a maquinaria do NMD consegue detetar um PTC quando este se encontra depositado 50-55 nucleótidos a montante da última junção exão-exão. Por outro lado, o destino do transcrito está dependente da distância entre o codão de iniciação e o PTC. Vários fatores foram interligados com cada um destes processos, nomeadamente fatores de splicing, da tradução e do decaimento, e novos intervenientes continuam a ser estudados. No entanto, ainda existem muitas questões mecanísticas e funções por esclarecer. Deste modo, é proposto neste projeto o estudo de um conjunto de proteínas que podem ter funções no NMD. A escolha das proteínas em estudo foi baseada em trabalhos previamente desenvolvidos no laboratório do metabolismo do mRNA (do Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge), em que se demonstrou que, em condições de knockdown por siRNA das proteínas hnRNPC1, FAM98A, SRRM1, eIF3l e eIF3j, os níveis de um transcrito repórter, alvo do NMD, aumentavam significativamente em comparação com condições controlo. De forma a validar estas proteínas como intervenientes no NMD, outros estudos precisam de ser efetuados, tais como a verificação da sua capacidade em ativar o mecanismo do NMD em transcritos não-alvos. Este foi o objetivo definido para este estudo. Para a sua realização, pensou-se numa estratégia com base no sistema de tethering da MS2. A proteína MS2-coat tem características favoráveis, tais como afinidade elevada ao seu local de ligação, sendo estas estruturas hairpin na cadeia de RNA. Após inserção destes locais de ligação na estrutura 3’UTR de um repórter, e depois de fundir as sequências da MS2 com as sequências das proteínas candidatas, é possível conduzir as candidatas ao transcrito repórter e verificar as alterações nos seus níveis de expressão. Idealmente, seria possível identificar as candidatas como novas proteínas do NMD se se verificasse uma redução significativa na expressão do mRNA repórter. A metodologia pensada para alcançar este objetivo envolveu, em primeiro lugar, a obtenção das sequências da MS2 e das candidatas por PCR. Os primers para estas amplificações foram desenhados com o intuito de possuir extremidades complementares um com o outro e/ou contendo locais de restrição de enzimas de clonagem. De seguida, as duas sequências deverão ser fundidas, via PCR de soeing. Esta técnica permite a recombinação de dois genes diferentes, dado que os primers usados na amplificação de cada um deles contém regiões de complementaridade um com o outro, tal como previsto. As sequências de fusão, após terem sido digeridas com enzimas de restrição, são subsequentemente ligadas num plasmídeo de expressão, também digerido, e este usado para transforma uma estirpe de bactérias competentes. A integridade da sequência é analisada por sequenciação de DNA, pelo método de Sanger. Quer-se também verificar se a sequência da MS2 e a sequência da candidata estão na mesma reading frame. Se estes critérios forem estabelecidos, o plasmídeo clonado deverá ser transfetado numa linha celular humana para ser expresso. Seguidamente, deverá ser verificada a integridade da proteína resultante, pelo método de Western blot. A proteína deverá ter um tamanho equivalente à soma dos tamanhos da MS2 e da proteína candidata. Só depois, o plasmídeo clonado seria co-transfetado com um plasmídeo contendo a sequência do gene repórter, e os seus níveis medidos por RT-qPCR. Estes últimos passos não foram possíveis de realizar. Neste trabalho são apresentadas diversas estratégias de otimização para cada passo da metodologia referida como, por exemplo, ao nível das concentrações usadas nas amplificações por PCR, a escolha da melhor polimerase para cada amplificação, a determinação do número de ciclos do PCR, a verificação da temperatura de annealing ótima para cada conjunto primer/template e, ainda, rácios molares e temperaturas de incubação ótimas para cada ligação vetor-fragmento. Com algumas das otimizações apresentadas, foi possível amplificar a sequência das candidatas hnRNPC1 e eIF3j, bem como a região codificante da proteína eIF3e, escolhida para exercer o papel de controlo positivo na experiência, visto que está comprovada a sua interveniência no NMD, como promotora. Recorrendo também a otimizações, foi possível fundir estas sequências com a da MS2 pelo método de soeing. A especificidade e eficiência de cada reação foi avaliada e, com base nos resultados, são apresentadas sugestões para amplificações futuras que não tenham sido bem sucedidas. Para além disto, foram encontradas outras dificuldades em passos diversos da metodologia, que impediram o cumprimento do objetivo inicial deste projeto. Exemplificando, não foi possível ligar a sequência da hnRNPC1 a um plasmídeo de expressão nem a sua clonagem em bactérias competentes. É, então, sugerido a adoção de controlos de ligação e transformação. Também não foi possível amplificar as sequências das candidatas FAM98A, SRRM1 e eIF3l. Suspeita-se que isto se terá devido à auto complementaridade entre primers, à baixa expressão dos transcritos nas linhas celulares das quais se sintetizou o template para as suas amplificações e à reduzida especificidade dos primers para o template. Neste caso, é sugerido que se desenhem novos primers e que se teste um conjunto maior de temperaturas de annealing. Apenas um construto foi obtido com sucesso, que continha clonada a sequência da MS2 fundida à da eIF3e. Como foi referido, a proteína eIF3e é um controlo positivo, por isso, não teria sentido avaliar o seu efeito nos níveis de expressão do mRNA repórter. Deste modo, apenas se verificou a integridade da proteína expressa por esta sequência, a qual dá origem a uma proteína de fusão com tamanho equivalente ao da proteína MS2 mais o da proteína eIF3e (66 kDa). Visto que o entendimento do NMD é de extrema importância, estudos desta natureza devem ser continuados. As proteínas sugeridas para esta dissertação apenas não foram validadas como intervenientes no NMD devido a dificuldades metodológicas, logo, deverão continuar a ser alvo de investigação. O trabalho aqui apresentado poderá servir de ponto de partida para estudos futuros, visto terem sido testadas diversas condições experimentais. Ainda que não tenha sido possível obter nenhum resultado do que era esperado, pode concluir-se quais as condições que não deverão ser repetidas. Em acréscimo, são também apresentadas sugestões para que os problemas aqui encontrados sejam de mais fácil resolução. Caso se venha a provar que estas proteínas têm de facto um papel no mecanismo do NMD, propõe-se o estudo de interações entre estas e outro fatores já conhecidos, por ensaios de coimunoprecipitação. Deste modo, esclarecer-se-ia em que parte do mecanismo do NMD as candidatas podem estar a intervir. Seria também interessante estudar quais os domínios da proteína têm papel nas suas interações, por análise mutacional.
Nonsense-mediated mRNA decay (NMD) is a tight post-transcriptional regulatory mechanism of gene expression, that acts by preventing translation termination of premature stop codon (PTC) containing transcripts. PTCs are at the base of 30 % of genetic disorders, making NMD relevant in the context of disease. Currently, there are two defined pathways that trigger NMD in cells. On one hand, the NMD machinery can detect the presence of a PTC if it is deposited 50-55 nt upstream from the last exon-exon junction. On the other hand, the transcript fate depends on the distance between the initiation codon and the PTC. Nevertheless, there are still some mechanistic events not quite clear, as well as their timeline and intervenients. It can be the case that unidentified proteins could clarify some of these questions. With that in mind, a set of promising proteins were investigated recurring to the MS2-tethering system, to try to validate them as novel NMD factors. The candidates hnRNPC1, FAM98A, SRRM1, eIF3l and eIF3j were to be fused to the MS2-coat protein coding sequence, cloned in an expression vector, and its effects on the levels of a β-globin NMD-evading transcript evaluated. However, some obstacles were met that prevented the achievement of this goal, namely difficulties in the ligation and cloning of the hnRNPC1 protein, and the PCR amplifications of the FAM98A, SRRM1 and eIF3l sequences. In this work, several optimization steps are described, which allowed the obtention of some fusion fragments. However, only one construct was cloned, that of the eIF3e, which would be the experiment positive control. Based on the experimental conditions tested that did not yield the desired results, one can draw some conclusions of what needs to be thought off in future experiments.
Nonsense-mediated mRNA decay (NMD) is a tight post-transcriptional regulatory mechanism of gene expression, that acts by preventing translation termination of premature stop codon (PTC) containing transcripts. PTCs are at the base of 30 % of genetic disorders, making NMD relevant in the context of disease. Currently, there are two defined pathways that trigger NMD in cells. On one hand, the NMD machinery can detect the presence of a PTC if it is deposited 50-55 nt upstream from the last exon-exon junction. On the other hand, the transcript fate depends on the distance between the initiation codon and the PTC. Nevertheless, there are still some mechanistic events not quite clear, as well as their timeline and intervenients. It can be the case that unidentified proteins could clarify some of these questions. With that in mind, a set of promising proteins were investigated recurring to the MS2-tethering system, to try to validate them as novel NMD factors. The candidates hnRNPC1, FAM98A, SRRM1, eIF3l and eIF3j were to be fused to the MS2-coat protein coding sequence, cloned in an expression vector, and its effects on the levels of a β-globin NMD-evading transcript evaluated. However, some obstacles were met that prevented the achievement of this goal, namely difficulties in the ligation and cloning of the hnRNPC1 protein, and the PCR amplifications of the FAM98A, SRRM1 and eIF3l sequences. In this work, several optimization steps are described, which allowed the obtention of some fusion fragments. However, only one construct was cloned, that of the eIF3e, which would be the experiment positive control. Based on the experimental conditions tested that did not yield the desired results, one can draw some conclusions of what needs to be thought off in future experiments.
Descrição
Tese de Mestrado, Biologia Humana e Ambiente, 2022, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências
Palavras-chave
Nonsense-mediated mRNA decay (NMD) Codão stop prematuro (PTC) Novas proteínas Sistema MS2-tethering Otimizações PCR Teses de mestrado - 2022