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Publicação
Search for novel compounds to prevent TrkB-FL cleavage
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Autores
Resumo(s)
A doença de Alzheimer (AD) é a doença neurodegenerativa mais comum compreendendo cerca de 60% a 80% dos 47 milhões de casos de demência no mundo. Está associada a alterações graves que resultam na perda irreversível de peso e volume cerebral afetando predominantemente as regiões do córtex e do corno de Ámon (CA1) do hipocampo, pela sua atrofia e perda de processos neuronais. São conhecidos dois tipos desta doença: o tipo “Esporádico” (SAD) associado a mutações na Apolipoproteína E (ApoE), em que de uma forma geral 95% dos doentes manifestam sintomas numa idade mais avançada (> 60-65 anos) e o tipo “Familiar” (FAD) associado a mutações na Proteína Percursora Amilóide (APP), representeando cerca de 5% dos casos sendo que os sintomas se manifestam-se numa idade mais precoce (<60-65 anos). Em termos neuropatológicos, os principais aspetos da AD compreendem a acumulação progressiva extracelular da proteína tóxica β-amilóide (Aβ) e a presença de novelos neurofibrilares intracelulares compostos pela hiperfosforilação da proteína tau. O Fator Neurotrófico Derivado do Cérebro (BDNF) é um membro da família das neurotrofinas (NTs) conhecido por mediar a neuroprotecção, homeostase neuronal, sobrevivência, diferenciação, transmissão e plasticidade sináptica. Estas ações são maioritariamente mediadas pela ativação de seu recetor de alta afinidade na isoforma completa, recetor de domínio tirosina quinase (TrkB-FL). Ao longo dos tempos, cada vez mais as alterações na sinalização mediada pelo BDNF têm vindo a ser consideradas como possíveis causas associadas a várias doenças neurodegenerativas como a AD. Estudos realizados no nosso laboratório têm tido como principal foco, o mecanismo responsável pela disfunção da sinalização mediada pelo BDNF/TrkB-FL na AD. Foi descoberto, pela primeira vez, que a acumulação da proteína Aβ promove uma ativação anormal dos recetores N-metil-D-Aspartato (NMDA), levando ao aumento dos níveis de cálcio (Ca2+) intracelulares, e consequentemente, a sobre ativação das enzimas calpaínas culimando assim na clivagem do recetor TrkB-FL. Consequentemente, são originados dois novos fragmentos: um recetor truncado ligado à membrana (TrkB-T') e um novo fragmento de domínio intracelular (TrkB-ICD). Desta forma a função neuroprotetora mediada pelo BDNF é perdida levando a processos de neurodegeneração. Contudo, foi desenvolvido, no nosso laboratório, um novo composto promissor, o péptido TAT-TrkB, capaz de prevenir a clivagem do recetor na presença de Aβ e restaurar as funções perdidas e mediadas pelo BDNF em estudos in vitro, ex vivo e in vivo. No entanto este composto, sendo de origem peptídica, pode trazer alguns contratempos nomeadamente no que concerne à sua produção. Em particular, os péptidos podem apresentar problemas relacionados com a sua permeabilidade, absorção e tempo de vida que podem dificultar os avanços clínicos do composto TAT-TrkB. Deste modo, e tendo como foco esta disfunção BDNF/TrkB-FL como um possível alvo terapêutico no tratamento da AD, decidimos explorar novas alternativas na esperança de encontrar um composto adicional ao TAT-TrkB. Assim, este trabalho teve como principal objetivo a procura por novos compostos (não péptidos) direcionados ao local de clivagem do recetor e avaliar a sua capacidade preventiva da clivagem do TrkB-FL mediada pelas calpaínas. Primeiramente, recorremos à abordagem in silico para a criação de modelos computacionais do TrkB-FL através do logaritmo I-TASSER que compreende a utilização de modelação de homologia clássica com métodos de adaptação molecular. Uma vez obtido o modelo final e refinado de acordo com as leis da química, foi realizada uma triagem virtual de compostos químicos recorrendo aos serviços do Texas Advanced Computer Center, para seleção final de 5 compostos promissores, respeitando os critérios de seleção: melhor função de Gibbs (energia libertada pelo composto quando ligado ao local de clivagem), capacidade de atravessar a barreira hematoencefálica, solubilidade em água, absorção gastrointestinal, menos interferência com citocromos e livres de patentes. De seguida, estes compostos foram testados in vitro em culturas corticais neuronais primárias utilizando fetos de ratos Sprague Dawley com 18 dias de gestação, na presença e ausência do insulto tóxico Aβ, com intuito de verificar se, efetivamente, estes compostos conseguiriam prevenir a clivagem do recetor TrkB-FL pelas calpaínas. Os compostos selecionados foram aplicados, em 4 concentrações diferentes (25, 50, 100 e 1000nM). Nos resultados obtidos na presença do composto B, e apesar de não terem sido observadas diferenças significativas nos níveis proteicos de TrkB-FL e TrkB-ICD individualmente, foi possível observar uma diminuição de 70% dos níveis basais de rácio (TrkB-ICD/TrkB-BFL), na ausência de qualquer insulto tóxico, nas concentrações estudadas de 25, 50 e 100nM e uma redução de 60% do mesmo rácio na última concentração testada de 1000nM comparativamente à condição controlo. Na presença do composto C na concentração testada de 100 nM, foi possível observar também uma diminuição de 70% dos níveis de rácio (TrkB-ICD/TrkB-FL) em comparação com a condição de controlo. Os compostos A, D e E não alteraram significativamente a clivagem do recetor TrkB-FL, não se observando diferenças nos níveis de TrkB-FL, TrkB-ICD e de rácio (TrkB-ICD/TrkB-FL). Assim, numa primeira fase os compostos B e C foram considerados como os candidatos mais promissores na prevenção da clivagem do recetor TrkB-FL. Posteriormente, no ensaio de viabilidade realizado, não foram encontradas alterações significativas na sobrevivência celular na presença destes compostos. Desta forma, estes resultados sugerem que na ausência do aumento da viabilidade celular na presença dos compostos B e C, os níveis fisiológicos basais de TrkB-ICD resultantes da clivagem basal do recetor TrkB-FL, não são relevantes para a sobrevivência celular apenas adquirindo significado quando esta clivagem é exacerbada, como no contexto de AD. Contudo é necessário aumentar o número de experiências devido ao elevado grau de variabilidade obtido. De acordo com os resultados ex vivo obtidos recorrendo a experiências de eletrofisiologia, na presença do composto B também não foram encontras alterações significativas nos potenciais excitatórios pós-sinápticos de campo (fEPSPs) em fatias de hipocampo. Assim, os resultados sugerem que este composto não altera os mecanismos base da transmissão sináptica hipocampal nas condições testadas. Contudo, e devido ao baixo número de experiências com o composto C, não podem ser retiradas informações conclusivas sobre o efeito deste composto, sendo necessário aumentar o número de experiências realizadas. Suplementarmente, foi de elevada importância proceder à avaliação das ações dos compostos na presença de Aβ in vitro. De facto, devido a um reduzido número de experiências de estudos piloto visando a co-incubação destes compostos com Aβ, não nos foi ainda possível retirar informações conclusivas dos níveis proteicos de TrkB-FL, TrkB ICD e de rácio (TrkB-ICD/TrkB-FL). Contudo, na co-incubação do composto E com Aβ apesar de ainda não terem sido observadas alterações significativas face à condição Aβ, este composto sugere potencial promissor na redução dos níveis de rácio na presença do insulto na concentração mais elevada. De tal forma, com o aumento do número de experiências poderemos confirmar ou não, o potencial promissor deste composto na prevenção/redução da clivagem do recetor. Estudos futuros visam principalmente a análise destes compostos de uma forma mais detalhada como o aumento do número de experiências para as abordagens realizadas in vitro, e o teste dos restantes compostos (B e D) na presença de Aβ. Adicionalmente, iremos avaliar o potencial terapêutico de outros compostos não contemplados no primeiro grupo dos 5 compostos selecionados (A, B, C, D e E). Relativamente a experiências ex vivo, para além do aumento do número de experiências, seria importante perceber como estes compostos atuariam na indução de processos como a Potenciação a Longo Prazo (LTP) e/ou na presença de insultos como Aβ. Outro aspeto a ser abordado seria a inclusão de novas experiências como a administração destes compostos in vivo em modelos animais da AD, para avaliar uma possível eficácia na aprendizagem e memória.
Alzheimer’s Disease (AD) is the commonest dementia worldwide. Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF) promotes neuronal protection through activation of its full length receptor, Tropomyosin-related Kinase B (TrkB-FL). In AD, the BDNF/TrkB-FL system is severely compromised due to an amyloid-beta (Aβ)-mediated TrkB-FL cleavage leading to the formation of two fragments: a truncated form (TrkB-T’) and an intracellular fragment (TrkB-ICD). Focusing on the BDNF/TrkB-FL signalling reestablishment as a potential therapeutic strategy for AD, the aim of this work was to search for small compounds to prevent TrkB-FL cleavage. A structural model of the TrkB-FL was built by homology modelling and molecular threading and to search for potential cleavage inhibitors, a virtual screening of chemical compounds was performed. The selected compounds were applied, in 4 different concentrations (25, 50, 100, and 1000nM), to primary neuronal cultures prepared from Sprague Dawley E18 fetuses. In the presence of compound B there was a 60-70% decrease of TrkB-ICD/Trk-BFL levels, in the absence of any toxic insult, in all studied concentrations compared to control condition and in the presence of compound C a 70 % decrease of TrkB-ICD/TrkB-FL levels compared to control condition. Compounds A, D, and E did not significantly change the cleavage of TrkB-FL receptor. Moreover, electrophysiology experiments in the present of compounds B and C did not show significative alterations compared to baseline. Also, viability essay did not show significative alterations in decreasing or increasing cell viability in the presence of these compounds. Altogether, data suggest that the compounds B and C may be promising candidates to prevent TrkB-FL receptor cleavage. It is now important to evaluate the effect of these compounds, but also the therapeutic potential of other small candidates not contemplated in the first cluster of 5 compounds, in the presence of Aβ, in ex vivo and in vivo experiments with AD animal models.
Alzheimer’s Disease (AD) is the commonest dementia worldwide. Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF) promotes neuronal protection through activation of its full length receptor, Tropomyosin-related Kinase B (TrkB-FL). In AD, the BDNF/TrkB-FL system is severely compromised due to an amyloid-beta (Aβ)-mediated TrkB-FL cleavage leading to the formation of two fragments: a truncated form (TrkB-T’) and an intracellular fragment (TrkB-ICD). Focusing on the BDNF/TrkB-FL signalling reestablishment as a potential therapeutic strategy for AD, the aim of this work was to search for small compounds to prevent TrkB-FL cleavage. A structural model of the TrkB-FL was built by homology modelling and molecular threading and to search for potential cleavage inhibitors, a virtual screening of chemical compounds was performed. The selected compounds were applied, in 4 different concentrations (25, 50, 100, and 1000nM), to primary neuronal cultures prepared from Sprague Dawley E18 fetuses. In the presence of compound B there was a 60-70% decrease of TrkB-ICD/Trk-BFL levels, in the absence of any toxic insult, in all studied concentrations compared to control condition and in the presence of compound C a 70 % decrease of TrkB-ICD/TrkB-FL levels compared to control condition. Compounds A, D, and E did not significantly change the cleavage of TrkB-FL receptor. Moreover, electrophysiology experiments in the present of compounds B and C did not show significative alterations compared to baseline. Also, viability essay did not show significative alterations in decreasing or increasing cell viability in the presence of these compounds. Altogether, data suggest that the compounds B and C may be promising candidates to prevent TrkB-FL receptor cleavage. It is now important to evaluate the effect of these compounds, but also the therapeutic potential of other small candidates not contemplated in the first cluster of 5 compounds, in the presence of Aβ, in ex vivo and in vivo experiments with AD animal models.
Descrição
Tese de mestrado, Neurociências, Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2022
Palavras-chave
Doença de Alzheimer Fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) Receptor trkB Clivagem Pequenos compostos Teses de mestrado - 2022