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Publicação
Influence of Guava Leaf Decoctions on Cholesterol Permeation through the Intestinal Barrier and Cholesterol Biosynthesis
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Orientador(es)
Resumo(s)
Psidium guajava L. leaf decoction has been used in traditional medicine due to its beneficial health effects, both in the prevention and treatment of diseases, namely hypercholesterolemia. This disorder consists of abnormally high levels of blood cholesterol and it’s a risk factor for the development of cardiovascular diseases. Cholesterol homeostasis is maintained through the endogenous synthesis, intestinal absorption, and hepatic excretion. The aim of this thesis was to evaluate the bioactivity and chemical composition of P. guajava leaf decoction and its influence on cholesterol absorption and metabolism. To do so, cholesterol permeation through the simulated intestinal barrier, inhibition of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase (HMGR), and inhibition of cholesterol transporters was assessed under the decoction’s influence. The aqueous extract (PG1) and the ethanolic precipitation supernatant (PG2) and pellet (PG3) from P. guajava leaf decoction were studied. It was observed that PG1 and PG2 were rich in phenolic compounds, whereas PG3 had low concentration of these bioactive molecules. The samples also possess strong antioxidant power (EC50 7.5 ± 0.4, 11.9 ± 0.5, and 7.3 ± 0.6 µg/mL for PG1, PG2, and PG3, respectively) and acetylcholinesterase inhibitory activity was only achieved by PG1 and PG2 (48.66 ± 1.39 and 63.44 ± 1.13 µg/mL for PG1 and PG2, respectively). In addition, PG1 and PG2 weren’t cytotoxic. Some phenolic compounds from PG1 and PG2 were able to permeate the intestinal barrier, ranging from 0.07 to 9.95%. The decoction also decreased cholesterol absorption in the simulated intestinal wall (55% and 24% for PG1 and PG2, respectively). The decoction inhibited cholesterol biosynthesis by inhibiting the HMGR activity (IC50 8.4 ± 0.5 µg/mL for PG1) and decreased the expression of cholesterol transporters NPC1L1 (ranging from 16 to 94%), ABCG5 (ranging from 28 to 98%), and ABCG8 (ranging from 24 to 80%). Additionally, FTIR data suggested a decrease in protein expression related to modifications at the transcription level. In conclusion, P. guajava leaf decoction was reported to influence cholesterol homeostasis at several levels, which helps explain its use and effects in traditional medicine.
Psidium guajava L., também conhecida por goiabeira, é uma pequena árvore nativa de áreas tropicais como a América Central e do Sul. No entanto, é capaz de crescer em diversos climas. As suas folhas são muito usadas sob a forma de decocção na medicina tradicional para prevenir e tratar de várias doenças e indisposições. Foi relatado que esta decocção apresenta propriedades antioxidantes, anti-inflamatórias, antimicrobianas e anti-hipercolesterolémicas. O racional por detrás destes efeitos está relacionado com a presença de moléculas com bioatividade conhecida como os compostos fenólicos (inclui maioritariamente ácidos fenólicos, flavonoides e taninos) e derivados, terpenos, ácido ascórbico, entre outros. Os compostos fenólicos são a maior classe de metabolitos secundários em plantas, sendo encontrados em quase todas as estruturas vegetais, como frutos, sementes, caules, folhas e raízes. Estas moléculas são dotadas de propriedades antioxidantes e anti-inflamatórias que têm efeitos positivos na saúde quando se consomem alimentos ricos neste tipo de compostos. De forma semelhante, os terpenos são moléculas com grande variedade estrutural e podem ser encontrados principalmente em frutos, vegetais e flores. São responsáveis pelo cheiro das plantas e também apresentam propriedades benéficas para a saúde ao funcionarem como agentes antimicrobianos, antihiperglicémicos e anti-inflamatórios. Estes dois grupos de moléculas, ao funcionarem como antioxidantes, resultantes das suas características estruturais, reduzem o stress oxidativo associado a várias doenças crónicas e degenerativas como cancro, doença de Alzheimer, diabetes, doenças cardiovasculares, entre outras. As doenças cardiovasculares são responsáveis por uma grande taxa de mortalidade em países desenvolvidos, sendo a hipercolesterolemia um dos principais fatores de risco. Esta é uma doença em que os níveis de colesterol estão elevados no sangue e tal pode provocar aterosclerose, cancro, síndrome metabólico e neurodegeneração. A homeostasia do colesterol pode ser regulada a vários níveis: através da síntese endógena no fígado, da absorção intestinal de colesterol proveniente da dieta e através do efluxo hepático. Sendo assim, é comum prescreverem-se fármacos como as Estatinas e a Ezetimiba que inibem, respetivamente, o enzima regulador da síntese de colesterol 3-hidroxi-3-metillglutaril coenzima A redutase (HMGR) e a absorção de colesterol da dieta no intestino ao interferir com a atividade dos transportadores de colesterol dos enterócitos. A hipercolesterolemia é também um fator de risco para o desenvolvimento da doença de Alzheimer. De notar que o enzima acetilcolinesterase (AChE) é um dos alvos terapêuticos da doença de Alzheimer e que, devido à sua atividade também nas junções neuromusculares, a sua inibição aumenta a motilidade intestinal. Assim, existe uma contribuição para a diminuição da absorção de colesterol da dieta no intestino. Foi relatado que o consumo de infusões e decocções de plantas ricas em compostos fenólicos diminuíram os níveis de colesterol no sangue de pessoas dispostas a tomar tais bebidas. Este tipo de observações realçam o potencial de decocções de plantas, como aquela feita de folhas de goiabeira, e o seu possível uso com fins terapêuticos. O objetivo deste estudo é determinar a bioatividade e composição química da decocção de folhas de P. guajava e compreender a sua influência na absorção e metabolismo do colesterol. Adicionalmente, foi estudada a influência da decocção num enzima envolvido na doença de Alzheimer e motilidade intestinal, o AChE. Para tal, vai ser avaliada a permeação de colesterol através da barreira intestinal simulada, a inibição do enzima HMGR e a inibição da expressão de transportadores de colesterol na presença de extratos provenientes da decocção de folhas de goiabeira. Prepararam-se três extratos a partir da decocção de folhas de goiabeira, nomeadamente o extrato aquoso (PG1), que mimetiza a decocção tal e qual como é consumida; o sobrenadante da precipitação com etanol (PG2) que corresponde a uma fração sem mucilagens, que mascaram a atividade e concentração de moléculas ativas; o pellet rico em mucilagens (PG3) cuja análise ajuda a compreender se houve co-precipitação de moléculas ativas. O conteúdo fenólico total e de flavonoides foi analisado em todas as amostras. O extrato aquoso foi o mais rico nestes dois grupos de moléculas. Estes valores refletem a presença de várias moléculas identificadas através de espetrometria de massa, nomeadamente quercetina, ácido clorogénico, ácido gálico, catequina e epigalocatequina. Também foram identificados derivados glicosídicos de quercetina como o hiperósido, a quercitrina e a guaijaverina. O terpenóide ácido jacoumárico foi também encontrado no extrato aquoso bem como alguns metabolitos primários. A atividade antioxidante foi analisada e constatou-se que as amostras são ativas e que o extrato aquoso era o mais antioxidante (EC50 7.5 ± 0.4, 11.9 ± 0.5 e 7.3 ± 0.6 µg/mL para o extrato aquoso, sobrenadante e pellet, respetivamente). Já para o ensaio da inibição do enzima AChE, apenas extrato aquoso e o sobrenadante obtiveram resultados e estes mostraram-se promissores (IC50 48.7 ± 1.4 e 63.4 ± 1.1 µg/mL, respetivamente). Com base nestas observações, não se utilizou mais o extrato das mucilagens. Antes de qualquer ensaio em linhas celulares, foi averiguada a citotoxicidade das amostras e chegou-se à conclusão de que nenhum era tóxico. A digestão in vitro com sucos gástrico e pancreático artificiais não exerceram modificações no extrato aquoso. Assim, as moléculas presentes nos extratos são capazes de chegar ao intestino sem sofrerem alterações significativas e o seu efeito neste órgão pode ser avaliado. Um destes ensaios é determinação da permeação de moléculas ativas através da barreira intestinal simulada com células Caco-2 diferenciadas num sistema Transwell. Esta análise permitiu observar que o ácido clorogénico, a quercetina, o ácido gálico, a catequina e a quercitrina são capazes de permear a barreira intestinal de modo a entrar na corrente sanguínea e alcançar outros alvos terapêuticos. No fígado ocorre a síntese endógena de colesterol cuja regulação é efetuada através da modulação da atividade do enzima limitante HMGR. O extrato aquoso mostrou ser capaz de inibir este enzima (IC50 8.4 ± 0.5 µg/mL) e reduzir os níveis de colesterol no sangue de forma semelhante às Estatinas, um fármaco utilizado para este fim. Neste ensaio foi obtido um valor de IC50 baixo mas maior que o IC50 das Estatinas. Outra forma de reduzir o nível de colesterol no sangue é através da inibição da absorção de colesterol proveniente da dieta no intestino. Tanto o extrato aquoso como o sobrenadante diminuíram a absorção de colesterol 55% e 24%, respetivamente. Para perceber como é que esta diminuição é provocada, a expressão dos transportadores de colesterol ABCG5, ABCG8 e NPC1L1 foi analisada através de Western Blot. Observou-se que a expressão destas proteínas diminuiu em células expostas aos dois extratos. A diminuição da expressão de NPC1L1 e o aumento da expressão de ABCG5 e ABCG8 é desejada para diminuir os valores de colesterol no sangue. Sendo assim, apenas a diminuição de expressão do transportador NPC1L1 pode explicar os efeitos benéficos da decocção de folhas de goiabeira. A espetrometria de FTIR foi utilizada para analisar os metabolitos de células hepáticas (HepG2) sob o efeito dos extratos aquoso e do sobrenadante. Ambas as amostras modificaram o perfil metabólico, sendo que houve uma diminuição da síntese proteica provocada por perturbações na transcrição de genes. Os lípidos também sofreram alterações a nível da sua síntese, sendo esta menor na presença de extrato. Também da análise por SDS-PAGE das proteínas provenientes de células Caco-2 se chegou à conclusão de que os extratos diminuem a quantidade de proteína nas células. Em conclusão, a decocção de folhas de P. guajava mostrou ser capaz de interferir na absorção e metabolismo de colesterol a vários níveis. Este efeito é resultante da inibição do enzima HMGR no fígado e da inibição da absorção de colesterol da dieta no intestino através da diminuição da expressão do transportador NPC1L1. Estas observações ajudam a compreender o racional por detrás do uso e justificar os efeitos observados na medicina tradicional.
Psidium guajava L., também conhecida por goiabeira, é uma pequena árvore nativa de áreas tropicais como a América Central e do Sul. No entanto, é capaz de crescer em diversos climas. As suas folhas são muito usadas sob a forma de decocção na medicina tradicional para prevenir e tratar de várias doenças e indisposições. Foi relatado que esta decocção apresenta propriedades antioxidantes, anti-inflamatórias, antimicrobianas e anti-hipercolesterolémicas. O racional por detrás destes efeitos está relacionado com a presença de moléculas com bioatividade conhecida como os compostos fenólicos (inclui maioritariamente ácidos fenólicos, flavonoides e taninos) e derivados, terpenos, ácido ascórbico, entre outros. Os compostos fenólicos são a maior classe de metabolitos secundários em plantas, sendo encontrados em quase todas as estruturas vegetais, como frutos, sementes, caules, folhas e raízes. Estas moléculas são dotadas de propriedades antioxidantes e anti-inflamatórias que têm efeitos positivos na saúde quando se consomem alimentos ricos neste tipo de compostos. De forma semelhante, os terpenos são moléculas com grande variedade estrutural e podem ser encontrados principalmente em frutos, vegetais e flores. São responsáveis pelo cheiro das plantas e também apresentam propriedades benéficas para a saúde ao funcionarem como agentes antimicrobianos, antihiperglicémicos e anti-inflamatórios. Estes dois grupos de moléculas, ao funcionarem como antioxidantes, resultantes das suas características estruturais, reduzem o stress oxidativo associado a várias doenças crónicas e degenerativas como cancro, doença de Alzheimer, diabetes, doenças cardiovasculares, entre outras. As doenças cardiovasculares são responsáveis por uma grande taxa de mortalidade em países desenvolvidos, sendo a hipercolesterolemia um dos principais fatores de risco. Esta é uma doença em que os níveis de colesterol estão elevados no sangue e tal pode provocar aterosclerose, cancro, síndrome metabólico e neurodegeneração. A homeostasia do colesterol pode ser regulada a vários níveis: através da síntese endógena no fígado, da absorção intestinal de colesterol proveniente da dieta e através do efluxo hepático. Sendo assim, é comum prescreverem-se fármacos como as Estatinas e a Ezetimiba que inibem, respetivamente, o enzima regulador da síntese de colesterol 3-hidroxi-3-metillglutaril coenzima A redutase (HMGR) e a absorção de colesterol da dieta no intestino ao interferir com a atividade dos transportadores de colesterol dos enterócitos. A hipercolesterolemia é também um fator de risco para o desenvolvimento da doença de Alzheimer. De notar que o enzima acetilcolinesterase (AChE) é um dos alvos terapêuticos da doença de Alzheimer e que, devido à sua atividade também nas junções neuromusculares, a sua inibição aumenta a motilidade intestinal. Assim, existe uma contribuição para a diminuição da absorção de colesterol da dieta no intestino. Foi relatado que o consumo de infusões e decocções de plantas ricas em compostos fenólicos diminuíram os níveis de colesterol no sangue de pessoas dispostas a tomar tais bebidas. Este tipo de observações realçam o potencial de decocções de plantas, como aquela feita de folhas de goiabeira, e o seu possível uso com fins terapêuticos. O objetivo deste estudo é determinar a bioatividade e composição química da decocção de folhas de P. guajava e compreender a sua influência na absorção e metabolismo do colesterol. Adicionalmente, foi estudada a influência da decocção num enzima envolvido na doença de Alzheimer e motilidade intestinal, o AChE. Para tal, vai ser avaliada a permeação de colesterol através da barreira intestinal simulada, a inibição do enzima HMGR e a inibição da expressão de transportadores de colesterol na presença de extratos provenientes da decocção de folhas de goiabeira. Prepararam-se três extratos a partir da decocção de folhas de goiabeira, nomeadamente o extrato aquoso (PG1), que mimetiza a decocção tal e qual como é consumida; o sobrenadante da precipitação com etanol (PG2) que corresponde a uma fração sem mucilagens, que mascaram a atividade e concentração de moléculas ativas; o pellet rico em mucilagens (PG3) cuja análise ajuda a compreender se houve co-precipitação de moléculas ativas. O conteúdo fenólico total e de flavonoides foi analisado em todas as amostras. O extrato aquoso foi o mais rico nestes dois grupos de moléculas. Estes valores refletem a presença de várias moléculas identificadas através de espetrometria de massa, nomeadamente quercetina, ácido clorogénico, ácido gálico, catequina e epigalocatequina. Também foram identificados derivados glicosídicos de quercetina como o hiperósido, a quercitrina e a guaijaverina. O terpenóide ácido jacoumárico foi também encontrado no extrato aquoso bem como alguns metabolitos primários. A atividade antioxidante foi analisada e constatou-se que as amostras são ativas e que o extrato aquoso era o mais antioxidante (EC50 7.5 ± 0.4, 11.9 ± 0.5 e 7.3 ± 0.6 µg/mL para o extrato aquoso, sobrenadante e pellet, respetivamente). Já para o ensaio da inibição do enzima AChE, apenas extrato aquoso e o sobrenadante obtiveram resultados e estes mostraram-se promissores (IC50 48.7 ± 1.4 e 63.4 ± 1.1 µg/mL, respetivamente). Com base nestas observações, não se utilizou mais o extrato das mucilagens. Antes de qualquer ensaio em linhas celulares, foi averiguada a citotoxicidade das amostras e chegou-se à conclusão de que nenhum era tóxico. A digestão in vitro com sucos gástrico e pancreático artificiais não exerceram modificações no extrato aquoso. Assim, as moléculas presentes nos extratos são capazes de chegar ao intestino sem sofrerem alterações significativas e o seu efeito neste órgão pode ser avaliado. Um destes ensaios é determinação da permeação de moléculas ativas através da barreira intestinal simulada com células Caco-2 diferenciadas num sistema Transwell. Esta análise permitiu observar que o ácido clorogénico, a quercetina, o ácido gálico, a catequina e a quercitrina são capazes de permear a barreira intestinal de modo a entrar na corrente sanguínea e alcançar outros alvos terapêuticos. No fígado ocorre a síntese endógena de colesterol cuja regulação é efetuada através da modulação da atividade do enzima limitante HMGR. O extrato aquoso mostrou ser capaz de inibir este enzima (IC50 8.4 ± 0.5 µg/mL) e reduzir os níveis de colesterol no sangue de forma semelhante às Estatinas, um fármaco utilizado para este fim. Neste ensaio foi obtido um valor de IC50 baixo mas maior que o IC50 das Estatinas. Outra forma de reduzir o nível de colesterol no sangue é através da inibição da absorção de colesterol proveniente da dieta no intestino. Tanto o extrato aquoso como o sobrenadante diminuíram a absorção de colesterol 55% e 24%, respetivamente. Para perceber como é que esta diminuição é provocada, a expressão dos transportadores de colesterol ABCG5, ABCG8 e NPC1L1 foi analisada através de Western Blot. Observou-se que a expressão destas proteínas diminuiu em células expostas aos dois extratos. A diminuição da expressão de NPC1L1 e o aumento da expressão de ABCG5 e ABCG8 é desejada para diminuir os valores de colesterol no sangue. Sendo assim, apenas a diminuição de expressão do transportador NPC1L1 pode explicar os efeitos benéficos da decocção de folhas de goiabeira. A espetrometria de FTIR foi utilizada para analisar os metabolitos de células hepáticas (HepG2) sob o efeito dos extratos aquoso e do sobrenadante. Ambas as amostras modificaram o perfil metabólico, sendo que houve uma diminuição da síntese proteica provocada por perturbações na transcrição de genes. Os lípidos também sofreram alterações a nível da sua síntese, sendo esta menor na presença de extrato. Também da análise por SDS-PAGE das proteínas provenientes de células Caco-2 se chegou à conclusão de que os extratos diminuem a quantidade de proteína nas células. Em conclusão, a decocção de folhas de P. guajava mostrou ser capaz de interferir na absorção e metabolismo de colesterol a vários níveis. Este efeito é resultante da inibição do enzima HMGR no fígado e da inibição da absorção de colesterol da dieta no intestino através da diminuição da expressão do transportador NPC1L1. Estas observações ajudam a compreender o racional por detrás do uso e justificar os efeitos observados na medicina tradicional.
Descrição
Tese de mestrado, Bioquímica (Bioquímica) Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2020
Palavras-chave
Psidium guajava L. colesterol compostos fenólicos transportadores de colesterol Teses de mestrado - 2020