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Publicação
Identification of novel determinants of effector γδ T cell differentiation
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Autores
Orientador(es)
Resumo(s)
O desenvolvimento de células T γδ é dependente da ação de vários mecanismos moleculares, que regulam a diferenciação destas células em linhagens distintas e também as suas capacidades efetoras. Os modelos atuais de diferenciação propõem que o desenvolvimento destas células ao nível do timo seja responsável por um “pré-comprometimento” das células T γδ para um de dois programas efetores, que se distinguem pelas citocinas efetoras produzidas: um programa produtor de IFN-γ (γδIFN) e um outro de IL-17 (γδ17). Segundo este modelo, uma forte estimulação do TCR e sua subsequente sinalização levam à formação de células comprometidas ao programa γδIFN, enquanto que sinais mais fracos ou ausentes promovem o programa γδ17. Para além do desenvolvimento no timo, níveis adicionais de regulação, como a ativação ou a repressão de expressão genética através da ação de fatores epigenéticos ou de transcrição, assim como a estimulação através de sinais extracelulares, como por exemplo a sinalização mediada por citocinas ou através de recetores de superfície, são responsáveis por regular a homeostase, as respostas efetoras e a plasticidade funcional das células γδ. As células T γδ funcionam como uma linha de defesa primária a patogénios por meio de respostas mediadas por citocinas, e o controlo da produção dessas citocinas, de entre as quais se destacam IFN-γ e IL-17, é essencial para a defesa do hospedeiro e para a manutenção da homeostase.
Neste trabalho, analisamos dois determinantes moleculares de sinalização do TCR descritos na literatura, CD6 e miR-181a, e o seu impacto no desenvolvimento e nas funções efetoras das células T γδ. Estas moléculas foram identificadas previamente no laboratório através de metodologias de “Next Generation Sequencing” como estando diferencialmente expressas entre os subgrupos γδIFN e γδ17, o que suscitou interesse por parte da nossa equipa em caraterizar melhor as suas funções na diferenciação de células T γδ. Na primeira parte desta tese, caracterizamos a expressão e o impacto de CD6 na proliferação e na produção de citocinas por parte de subpopulações de células T γδ. CD6 é um regulador de sinalização através do TCR pouco caraterizado em células T γδ, e as suas funções em células T convencionais são controversas, tendo sido identificado tanto como estimulador de sinalização via TCR, como repressor, ou como ambos. Com o intuito de avaliar a expressão do miR-181a nas diversas subpopulações de células T γδ, estas células foram recolhidas a partir dos timos, gânglios linfáticos e baços de ratinhos C57BL/6 e segregadas em subpopulações distintas de acordo com a expressão de marcadores de superfície caraterísticos por citometria de fluxo. De seguida, os níveis de expressão de miR-181a nas subpopulações de células T γδ foram analisados por RT-qPCR, revelando um aumento de expressão por parte deste miRNA na subpopulação γδIFN em comparação com a subpopulação γδ17. No seguimento destas observações, utilizamos um modelo de ratinho com deficiência em miR-181a/b-1 de modo a examinar se esta molécula afetaria a diferenciação de células T γδ. Comparativamente aos ratinhos WT, os ratinhos miR-181a-/- apresentam um aumento na percentagem de células γδIFN na periferia. Estes dados sugerem que o miR-181a promove o o programa γδ17 na periferia.
De modo a caraterizar melhor os mecanismos por detrás do impacto do miR-181a na diferenciação das subpopulações de linfócitos T γδ, geramos uma lista abrangente de genes-alvo do miR-181a-5p. Esta lista é composta por genes-alvo expressos diferencialmente entre γδIFN e γδ17, e que adicionalmente foram previamente descritos como tendo um efeito na secreção de IFN-γ ou IL-17 por parte de células T e que participam na regulação de eventos de sinalização na sequência de estimulação do TCR. Identificamos 36 genes que correspondem aos nossos critérios, 14 dos quais apoiam nossa hipótese de que o miR-181a promove o programa efetor γδ17 por meio da modulação da força da sinalização do TCR. Esses 14 genes foram ADAM12, AHNAK, AKT3, CD53, FASL, FUT8, GPD2, ID2, IFNG, INSR, PAK1, SGMS1, TGFBR3 e THEMIS. Para examinar o impacto do miR-181a na expressão desses genes-alvo, utilizamos subpopulações de células T γδ recolhidas a partir dos gânglios linfáticos de ratinhos selvagens e de ratinhos “knockout” para miR-181a/b-1 através de citometria de fluxo, e realizamos uma análise de expressão através de RT-qPCR. Observamos que apenas três genes, FUT8, PAK1 e THEMIS, apresentavam níveis significativamente diminuídos na presença de miR-181a-5p, e apenas na subpopulação γδIFN. Inesperadamente, a expressão de AHNAK encontrava-se aumentada em ratinhos WT, mas apenas na subpopulação γδ “naïve”. Experiências adicionais serão necessárias para investigar os mecanismos moleculares através dos quais os genes-alvo podem modular a sinalização do TCR e a diferenciação nas células T γδ. Atualmente, a nossa hipótese postula que o miR-181a pode atuar de modo a potencializar eventos de sinalização mais fracos ou na ausência de estimulação de TCR, e/ou inibir a estimulação forte do TCR das células T γδ, promovendo assim a diferenciação de γδ17.
Em suma, o trabalho apresentado nesta tese identifica CD6 e o miR-181a como reguladores putativos dos eventos de diferenciação e das funções efetoras das células T γδ por meio da regulação da sinalização do TCR e de vias adjacentes. Este trabalho contribui assim para a caracterização da identidade celular e fisiologia das células T γδ, gerando também novas possibilidades de modulação terapêutica.
γδ T cells are unconventional lymphocytes that have been shown to play important roles in immune responses to infections and cancer. In this work, we analyze the role of two modulators of T cell receptor (TCR) signaling, CD6 and miR-181a, on the differentiation and activation of γδ T cell subsets. In the first part of this thesis, we characterize the expression and impact of CD6 on γδ T cell subset proliferation and cytokine production. Our data indicates an upregulation of CD6 expression in IFN-γ-producing (γδIFN) compared to IL-17-producing (γδ17) cells, and that CD6 promotes γδIFN proliferation in steady-state. Furthermore, CD6 mutant mice exhibited reduced susceptibility to cerebral malaria upon Plasmodium infection, consistent with a reduced IFN-γ response by γδ T cells. Our observations suggest that CD6 acts as a promoter of TCR signaling and γδIFN effector functions. In the second part of this thesis, we identify miR-181a as a putative player in TCR-mediated γδ T cell differentiation. miR-181a expression levels were upregulated in the γδIFN subpopulation when compared to γδ17 cells. Mice deficient for miR-181a/b-1 exhibited an increase in the percentage of γδIFN cells in the periphery and a decrease in γδ17 cells. Furthermore, we generated a comprehensive list of miR-181a-5p target genes differentially expressed between γδIFN and γδ17, and that play a role in IFN-γ/IL-17 programs and TCR signaling. RT-qPCR analysis of γδ T cell subsets collected from wild-type and miR-181a-/- mice revealed that three target genes, FUT8, PAK1 and THEMIS, are significantly downregulated by miR-181a-5p in the γδIFN subset, thus constituting interesting candidates for future analyses. In sum, our work identified CD6 and miR-181a as putative regulators of γδ T cell differentiation and effector functions via regulation of TCR signaling, which may open new avenues for their therapeutic modulation.
γδ T cells are unconventional lymphocytes that have been shown to play important roles in immune responses to infections and cancer. In this work, we analyze the role of two modulators of T cell receptor (TCR) signaling, CD6 and miR-181a, on the differentiation and activation of γδ T cell subsets. In the first part of this thesis, we characterize the expression and impact of CD6 on γδ T cell subset proliferation and cytokine production. Our data indicates an upregulation of CD6 expression in IFN-γ-producing (γδIFN) compared to IL-17-producing (γδ17) cells, and that CD6 promotes γδIFN proliferation in steady-state. Furthermore, CD6 mutant mice exhibited reduced susceptibility to cerebral malaria upon Plasmodium infection, consistent with a reduced IFN-γ response by γδ T cells. Our observations suggest that CD6 acts as a promoter of TCR signaling and γδIFN effector functions. In the second part of this thesis, we identify miR-181a as a putative player in TCR-mediated γδ T cell differentiation. miR-181a expression levels were upregulated in the γδIFN subpopulation when compared to γδ17 cells. Mice deficient for miR-181a/b-1 exhibited an increase in the percentage of γδIFN cells in the periphery and a decrease in γδ17 cells. Furthermore, we generated a comprehensive list of miR-181a-5p target genes differentially expressed between γδIFN and γδ17, and that play a role in IFN-γ/IL-17 programs and TCR signaling. RT-qPCR analysis of γδ T cell subsets collected from wild-type and miR-181a-/- mice revealed that three target genes, FUT8, PAK1 and THEMIS, are significantly downregulated by miR-181a-5p in the γδIFN subset, thus constituting interesting candidates for future analyses. In sum, our work identified CD6 and miR-181a as putative regulators of γδ T cell differentiation and effector functions via regulation of TCR signaling, which may open new avenues for their therapeutic modulation.
Descrição
Tese de mestrado, Investigação Biomédica, Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2024
Palavras-chave
Células T γδ Diferenciação MicroRNA Sinalização por TCR Interferon gama Interleucina-17 Teses de mestrado - 2024