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Targeting hepatocyte necroptosis to treat liver diseases
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Abstract(s)
Chronic liver diseases are considered a major public health concern, and their prevalence and incidence are increasing with serious long-term implications, such as cirrhosis, hepatocellular carcinoma (HCC) and, ultimately, premature death. In particular, non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) and chronic cholestatic liver disease are two distinct pathologic conditions sharing a progressive nature and lacking effective medical therapies. Persistent cell death represents a dominant trigger for chronic inflammation, fibrosis and compensatory cell proliferation, increasing the risk of cancer. Of note, necroptosis or regulated necrosis, which depends on kinase activity of receptor-interacting protein 3 (RIP3), was recently described as novel immunogenic type of cell death that may pathologically impinge on inflammation-driven liver diseases. The main goal of the work presented in this thesis was to evaluate the role of necroptosis in human and experimental models of NAFLD and cholestatic liver disease, and to test whether its inhibition could provide potential therapeutic benefits. First, the role of necroptosis in human and experimental NAFLD was evaluated. We showed that hepatic necroptosis is triggered in NAFLD patients and in two dietary models of non-alcoholic steatohepatitis (NASH), playing a role in disease progression. Indeed, inhibition of necroptosis through genetic ablation of Rip3 attenuated liver injury, steatosis, inflammation, fibrosis and oxidative stress in mice fed a methionine- and choline-deficient NASH-inducing diet. In turn, tumor necrosis factor-α (TNF-α) was shown to trigger RIP3-dependent oxidative stress during hepatocyte necroptosis. We next explored the role of RIP3-dependent signaling in NAFLD-associated HCC using the choline-deficient L amino acid-defined (CDAA) diet murine model. Remarkably, despite associating with increased insulin resistance and hepatic steatosis, absence of RIP3 decreased long-term inflammation and fibrosis, compensatory proliferation of hepatocytes, oxidative stress, genetic cell death resistance in dysplastic hepatocytes, and tissue microenvironment alterations closely associated with NAFLD-driven hepatocarcinogenesis. In parallel, we evaluated the role of necroptosis in mediating deleterious processes associated with cholestatic liver disease. Our results showed that necroptosis is triggered in the liver of primary biliary cholangitis patients (PBC), mediating hepatic necro-inflammation induced by common bile duct ligation (BDL) in mice. However, deletion of Rip3 failed to prevent BDL-induced secondary biliary fibrosis and was associated with enhanced chronic cholestasis and hepatic iron accumulation, through up-regulation of heme oxygenase-1. As an alternative putative therapeutic approach, we next evaluated whether ablation of microRNA-21 (miR-21) could simultaneously prevent necroptosis and fibrosis in BDL mice. Functional studies established the association between miR-21, its target cyclin dependent kinase 2 associated protein 1 (CDK2AP1) and necroptosis. Further, miR-21 was found increased in the liver of PBC patients and BDL mice, whereas deletion of miR-21 attenuated necroptosis, liver damage, oxidative stress and expression of pro-fibrogenic genes in BDL mice. miR-21 ablation further improved BDL-induced adaptive responses in bile acid homeostasis. Taken together, our studies highlight that inhibition of necroptosis may, at least partially, inhibit NAFLD and NAFLD-associated HCC, as well as cholestatic liver disease pathogenesis. miR-21 inhibition reduces necroptosis and may also afford complementary protective effects. A broader understanding of necroptosis and its intricate role in liver pathophysiology is likely to provide a rationale for the development of therapeutic strategies for NAFLD and cholestatic liver disease based on the targeting of necroptosis-associated signaling pathways.
As doenças crónicas do fígado são consideradas um grande problema de saúde pública dada a sua elevada prevalência e incidência, em paralelo com a ocorrência de graves complicações a longo prazo, como cirrose, carcinoma hepatocelular (CHC) e, em última instância, morte prematura. Em particular, o fígado gordo não-alcoólico (FGNA) e a doença hepática colestática crónica são duas condições patológicas distintas, mas que têm em comum um desenvolvimento de natureza progressiva e a falta de terapias médicas eficazes. Por sua vez, a morte celular persistente é dominante no desencadear de inflamação crónica, fibrose e proliferação celular compensatória, aumentando o risco de desenvolvimento de cancro. De facto, a ativação dos recetores de morte pelo fator de necrose tumoral-α (TNF-α) e por outros ligandos tem sido largamente implicada em patologias hepáticas. No entanto, a maioria dos estudos publicados até agora tem-se focado na apoptose como consequência desta ativação, descurando-se o papel da necrose que representa, também, uma característica fundamental das doenças hepáticas. Em particular, a necrose regulada ou necroptose foi recentemente descrita como uma via de morte celular, morfologicamente semelhante à necrose, mas ocorrendo de forma regulada e, portanto, sendo passível de possíveis intervenções terapêuticas dirigidas. Em termos clássicos, a necroptose ocorre a jusante TNF-α e depende das cinases receptor-interacting protein 1 (RIP1) e 3 (RIP3). No entanto, em contextos celulares específicos, o aumento dos níveis de RIP3 é suficiente para desencadear a necroptose, salientando o seu papel fundamental na regulação deste processo de morte. Por seu turno, a cinase RIP3 recruta e fosforila a proteína mixed lineage kinase domain-like (MLKL), a qual oligomeriza e forma poros nas membranas celulares, desempenhando um papel crítico na execução da necroptose. Como o resultado final, a célula é permeabilizada, com a libertação concomitante do seu conteúdo celular imunogénico e, por esta razão, a necroptose tem sido implicada na patogénese de doenças inflamatórias. O objetivo principal desta tese foi avaliar o papel da necroptose na patogénese do FGNA e da doença hepática colestática, e se a sua inibição poderá constituir uma potencial abordagem terapêutica. O FGNA é a doença hepática crónica mais comum nos países ocidentais e apresenta uma prevalência e incidência crescentes devido à sua forte associação com obesidade e síndrome metabólico. O FGNA engloba um espectro de disfunção hepática, que vai desde a esteatose simples à esteatohepatite não alcoólica (EHNA), a qual está associada a inflamação e morte celular e que, por sua vez, pode evoluir para cirrose e CHC. Os nossos resultados mostram que o aumento da expressão hepática de RIP3 é um denominador comum a várias doenças hepáticas crónicas, nomeadamente FGNA, mas também esteatohepatite alcoólica e hepatites crónicas virais. Além disso, doentes com FGNA apresentam níveis aumentados de marcadores gerais de necrose em circulação, bem como aumento da fosforilação de MLKL no fígado, uma característica distintiva da ativação da necroptose. A avaliação da fosforilação de MLKL e do sequestro de RIP3 e MLKL nas frações proteicas insolúveis de fígado de murganho indicaram que a necroptose também se encontra ativa no fígado em animais alimentados com duas dietas diferentes indutoras de FGNA. Mais ainda, a inibição da necroptose através do silenciamento genético de RIP3, reduziu o dano hepático, a esteatose, a inflamação, a fibrose e o stress oxidativo. Estudos funcionais em hepatócitos primários de roedores demonstraram, ainda, uma associação entre o estímulo TNF-α e a indução de stress oxidativo dependente da sinalização por RIP3. De seguida, avaliou-se o do papel da necroptose na progressão da EHNA para CHC. Para recapitular o espectro completo do FGNA e da sua progressão para CHC, utilizou-se um modelo experimental baseado na dieta deficiente em colina e com a composição em aminoácidos definida (CDAA), um modelo validado de CHC dependente de FGNA. Neste modelo, murganhos alimentados com a dieta CDAA durante 32 semanas apresentaram EHNA, enquanto que a alimentação até às 66 semanas induziu a formação de nódulos pré neoplásicos/neoplásicos. Por outro lado, a ausência de RIP3 reduziu a inflamação e a fibrose durante a alimentação com a dieta CDAA por 66 semanas, refletindo-se numa melhoria da evidência histológica de EHNA. Além disso, e embora o número de nódulos não tenha sido significativamente afetado pela ausência de RIP3, estes animais apresentaram uma diminuição da proliferação compensatória dos hepatócitos, assim como níveis reduzidos de stress oxidativo e resistência genética à morte celular em hepatócitos displásicos, para além de normalização de vias de sinalização envolvidas na criação do microambiente tumoral. Ainda assim, os murganhos knockout RIP3 revelaram um maior aumento de peso corporal ao longo do tempo, hiperlipidémia e aumento da resistência à insulina, particularmente após 32 semanas. Assim, a inibição da necroptose poderá constituir uma nova abordagem para travar a progressão de EHNA para fibrose e CHC, embora estudos futuros devam avaliar o risco de efeitos metabólicos adversos associados à inibição de RIP3. Em paralelo com o estudo da necroptose no FGNA, também se avaliou o papel da morte celular na patogénese da doença hepática colestática. Os resultados mostraram que a coloração com tioflavina T e a expressão de RIP3 e MLKL estavam significativamente aumentadas no fígado de doentes com colangite biliar primária (CBP), indicando a ativação de necroptose. Num modelo experimental de colestase aguda e fibrose biliar secundária, por laqueação do ducto biliar comum (LDB), observou-se hiperplasia progressiva dos ductos biliares, necrose multifocal, fibrose e inflamação, com a concomitante ativação de necroptose no fígado, demonstrada pelo aumento de expressão e atividade de RIP3, assim como pela acumulação de RIP3 e MLKL na fração proteica insolúvel do fígado. Por outro lado, a ausência de RIP3 suprimiu a necrose e inflamação aguda e crónica, após a LDB. Os níveis séricos das enzimas hepáticas, a expressão hepática de citocinas pró inflamatórias e fibrogénicas, assim como o stress oxidativo estavam também diminuídos em murganhos knockout RIP3, 3 dias após a LDB (fase aguda). No entanto, aos 14 dias (fase crónica), a colestase foi agravada e a fibrose manteve-se inalterada, ao mesmo tempo que foi detetado um aumento da proteína heme oxygenease-1 e acumulação de ferro. Face aos resultados anteriores, e uma vez que foi já demonstrado que a inibição do miR-21 previne a necroptose no pâncreas de murganhos, assim como a fibrose biliar secundária induzida pela LDB, avaliou-se se a inibição genética do miR-21 reduz a necrose, a inflamação e a fibrose associadas à LDB. Estudos iniciais em hepatócitos primários de murganho estabeleceram uma ligação funcional entre o miR-21 e a necroptose através da cyclin dependent kinase 2 associated protein 1 (CDK2AP1). Verificou-se, também, que o miR-21 estava aumentado no fígado de doentes com CBP e em ratinhos sujeitos a LDB. A ablação genética de miR-21 atenuou a necroptose, o dano hepático e o stress oxidativo, assim como a expressão de genes pro-fibrogénicos. Mais ainda, ratinhos deficientes em miR-21 apresentaram também uma resposta adaptativa melhorada na homeostase dos ácidos biliares. Estes resultados indicam que a necroptose representa um evento patogénico da doença colestática e sugerem a inibição do miR-21 como uma estratégia promissora para o tratamento das doenças hepáticas colestáticas. No seu todo, estes estudos indicam que a inibição da necroptose poderá, pelo menos em parte, inibir a patogénese do FGNA e do CHC associado ao FGNA, assim como da doença colestática. A inibição do miR-21 reduz a necroptose e pode, ainda, apresentar outros efeitos citoprotetores complementares. Uma melhor compreensão da necroptose e dos seus efeitos múltiplos e intricados na fisiopatologia da doença hepática deverá, certamente, contribuir para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas para o FGNA e doença colestática baseadas na modulação daquelas vias de sinalização celular.
As doenças crónicas do fígado são consideradas um grande problema de saúde pública dada a sua elevada prevalência e incidência, em paralelo com a ocorrência de graves complicações a longo prazo, como cirrose, carcinoma hepatocelular (CHC) e, em última instância, morte prematura. Em particular, o fígado gordo não-alcoólico (FGNA) e a doença hepática colestática crónica são duas condições patológicas distintas, mas que têm em comum um desenvolvimento de natureza progressiva e a falta de terapias médicas eficazes. Por sua vez, a morte celular persistente é dominante no desencadear de inflamação crónica, fibrose e proliferação celular compensatória, aumentando o risco de desenvolvimento de cancro. De facto, a ativação dos recetores de morte pelo fator de necrose tumoral-α (TNF-α) e por outros ligandos tem sido largamente implicada em patologias hepáticas. No entanto, a maioria dos estudos publicados até agora tem-se focado na apoptose como consequência desta ativação, descurando-se o papel da necrose que representa, também, uma característica fundamental das doenças hepáticas. Em particular, a necrose regulada ou necroptose foi recentemente descrita como uma via de morte celular, morfologicamente semelhante à necrose, mas ocorrendo de forma regulada e, portanto, sendo passível de possíveis intervenções terapêuticas dirigidas. Em termos clássicos, a necroptose ocorre a jusante TNF-α e depende das cinases receptor-interacting protein 1 (RIP1) e 3 (RIP3). No entanto, em contextos celulares específicos, o aumento dos níveis de RIP3 é suficiente para desencadear a necroptose, salientando o seu papel fundamental na regulação deste processo de morte. Por seu turno, a cinase RIP3 recruta e fosforila a proteína mixed lineage kinase domain-like (MLKL), a qual oligomeriza e forma poros nas membranas celulares, desempenhando um papel crítico na execução da necroptose. Como o resultado final, a célula é permeabilizada, com a libertação concomitante do seu conteúdo celular imunogénico e, por esta razão, a necroptose tem sido implicada na patogénese de doenças inflamatórias. O objetivo principal desta tese foi avaliar o papel da necroptose na patogénese do FGNA e da doença hepática colestática, e se a sua inibição poderá constituir uma potencial abordagem terapêutica. O FGNA é a doença hepática crónica mais comum nos países ocidentais e apresenta uma prevalência e incidência crescentes devido à sua forte associação com obesidade e síndrome metabólico. O FGNA engloba um espectro de disfunção hepática, que vai desde a esteatose simples à esteatohepatite não alcoólica (EHNA), a qual está associada a inflamação e morte celular e que, por sua vez, pode evoluir para cirrose e CHC. Os nossos resultados mostram que o aumento da expressão hepática de RIP3 é um denominador comum a várias doenças hepáticas crónicas, nomeadamente FGNA, mas também esteatohepatite alcoólica e hepatites crónicas virais. Além disso, doentes com FGNA apresentam níveis aumentados de marcadores gerais de necrose em circulação, bem como aumento da fosforilação de MLKL no fígado, uma característica distintiva da ativação da necroptose. A avaliação da fosforilação de MLKL e do sequestro de RIP3 e MLKL nas frações proteicas insolúveis de fígado de murganho indicaram que a necroptose também se encontra ativa no fígado em animais alimentados com duas dietas diferentes indutoras de FGNA. Mais ainda, a inibição da necroptose através do silenciamento genético de RIP3, reduziu o dano hepático, a esteatose, a inflamação, a fibrose e o stress oxidativo. Estudos funcionais em hepatócitos primários de roedores demonstraram, ainda, uma associação entre o estímulo TNF-α e a indução de stress oxidativo dependente da sinalização por RIP3. De seguida, avaliou-se o do papel da necroptose na progressão da EHNA para CHC. Para recapitular o espectro completo do FGNA e da sua progressão para CHC, utilizou-se um modelo experimental baseado na dieta deficiente em colina e com a composição em aminoácidos definida (CDAA), um modelo validado de CHC dependente de FGNA. Neste modelo, murganhos alimentados com a dieta CDAA durante 32 semanas apresentaram EHNA, enquanto que a alimentação até às 66 semanas induziu a formação de nódulos pré neoplásicos/neoplásicos. Por outro lado, a ausência de RIP3 reduziu a inflamação e a fibrose durante a alimentação com a dieta CDAA por 66 semanas, refletindo-se numa melhoria da evidência histológica de EHNA. Além disso, e embora o número de nódulos não tenha sido significativamente afetado pela ausência de RIP3, estes animais apresentaram uma diminuição da proliferação compensatória dos hepatócitos, assim como níveis reduzidos de stress oxidativo e resistência genética à morte celular em hepatócitos displásicos, para além de normalização de vias de sinalização envolvidas na criação do microambiente tumoral. Ainda assim, os murganhos knockout RIP3 revelaram um maior aumento de peso corporal ao longo do tempo, hiperlipidémia e aumento da resistência à insulina, particularmente após 32 semanas. Assim, a inibição da necroptose poderá constituir uma nova abordagem para travar a progressão de EHNA para fibrose e CHC, embora estudos futuros devam avaliar o risco de efeitos metabólicos adversos associados à inibição de RIP3. Em paralelo com o estudo da necroptose no FGNA, também se avaliou o papel da morte celular na patogénese da doença hepática colestática. Os resultados mostraram que a coloração com tioflavina T e a expressão de RIP3 e MLKL estavam significativamente aumentadas no fígado de doentes com colangite biliar primária (CBP), indicando a ativação de necroptose. Num modelo experimental de colestase aguda e fibrose biliar secundária, por laqueação do ducto biliar comum (LDB), observou-se hiperplasia progressiva dos ductos biliares, necrose multifocal, fibrose e inflamação, com a concomitante ativação de necroptose no fígado, demonstrada pelo aumento de expressão e atividade de RIP3, assim como pela acumulação de RIP3 e MLKL na fração proteica insolúvel do fígado. Por outro lado, a ausência de RIP3 suprimiu a necrose e inflamação aguda e crónica, após a LDB. Os níveis séricos das enzimas hepáticas, a expressão hepática de citocinas pró inflamatórias e fibrogénicas, assim como o stress oxidativo estavam também diminuídos em murganhos knockout RIP3, 3 dias após a LDB (fase aguda). No entanto, aos 14 dias (fase crónica), a colestase foi agravada e a fibrose manteve-se inalterada, ao mesmo tempo que foi detetado um aumento da proteína heme oxygenease-1 e acumulação de ferro. Face aos resultados anteriores, e uma vez que foi já demonstrado que a inibição do miR-21 previne a necroptose no pâncreas de murganhos, assim como a fibrose biliar secundária induzida pela LDB, avaliou-se se a inibição genética do miR-21 reduz a necrose, a inflamação e a fibrose associadas à LDB. Estudos iniciais em hepatócitos primários de murganho estabeleceram uma ligação funcional entre o miR-21 e a necroptose através da cyclin dependent kinase 2 associated protein 1 (CDK2AP1). Verificou-se, também, que o miR-21 estava aumentado no fígado de doentes com CBP e em ratinhos sujeitos a LDB. A ablação genética de miR-21 atenuou a necroptose, o dano hepático e o stress oxidativo, assim como a expressão de genes pro-fibrogénicos. Mais ainda, ratinhos deficientes em miR-21 apresentaram também uma resposta adaptativa melhorada na homeostase dos ácidos biliares. Estes resultados indicam que a necroptose representa um evento patogénico da doença colestática e sugerem a inibição do miR-21 como uma estratégia promissora para o tratamento das doenças hepáticas colestáticas. No seu todo, estes estudos indicam que a inibição da necroptose poderá, pelo menos em parte, inibir a patogénese do FGNA e do CHC associado ao FGNA, assim como da doença colestática. A inibição do miR-21 reduz a necroptose e pode, ainda, apresentar outros efeitos citoprotetores complementares. Uma melhor compreensão da necroptose e dos seus efeitos múltiplos e intricados na fisiopatologia da doença hepática deverá, certamente, contribuir para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas para o FGNA e doença colestática baseadas na modulação daquelas vias de sinalização celular.
Description
Tese de doutoramento, Farmácia (Biologia Celular e Molecular), Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2017
Keywords
Teses de doutoramento - 2017